摘要：目的：观察单味五叶草莓醇提物对S180荷瘤小鼠的影响，探讨五叶草莓抗肿瘤效果及可能机制。方法：对S180荷瘤小鼠实体瘤模型予以单味五叶草莓醇提物及CTX治疗，观察抑瘤率，胸腺、脾脏指数及肿瘤细胞中VEGF、bFGF的蛋白表达，并进行疗效分析。结果：CTX组及五叶草莓高、低剂量组的抑瘤率分别为51.69%、45.05%、37.77%，提示环磷酰胺的抑瘤率最高，五叶草莓有一定的抑瘤率；五叶草莓高剂量组与模型组比较脾脏指数明显升高，且具有显著差异（P 1.3.3主要实验仪器GTK-2002自动恒温摊拷烘片机（西安瑞丰仪器设备有限公司），ZMN-7803自动组织包埋机（西安瑞丰仪器设备有限公司），LQ-A包埋蜡块修整仪（西安瑞丰仪器设备有限公司），YABO600电脑自动脱水机（常州市雅博电子设备有限公司），Motic显微镜及照相系统(Motic公司)，旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；电热恒温水浴箱（北京西城区医疗器械厂）；循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；电热鼓风干燥箱（北京科伟永鑫实验仪器设备厂）；电子天平（抚顺宇辰衡器有限公司），手术刀，止血钳，试管等。
2方法
2.1动物分组、模型制作及给药
所有小鼠先适应性喂养7天，后将在无菌条件下接种7天的荷瘤S180腹水瘤小鼠的腹水与PBS液按1∶3的比例进行稀释，离心后弃上清液，并用红细胞计数板计数瘤细胞 [(2～3)×107个/mL]，用台盼蓝溶液染色进行活细胞计数，若活细胞率＞95%后，在小鼠左腋皮下注射0. 2mL稀释液，制成实体瘤模型。参照《药理实验方法学》[1]将上述已接种S180腹水型肉瘤的昆明种鼠，于接种24h后随机分成4组，为空白组、模型组、CTX组、五叶草莓高、低2个剂量组共5组，各组体重无明显差异。模型组根据体重按0.2mL/10g用生理盐水灌胃1次，环磷酰胺（CTX）按0.04g/kg每天腹腔注射1次，高剂量组按生药量计算为8.26g?kg-1?d-1,用生理盐水将浸膏稀释，予0.4mL/只/日灌胃，低剂量组按生药量计算为4.13g?kg-1?d-1,用生理盐水将浸膏稀释，予0.4mL/只，灌胃，日1次。
毛色，精神，行动，进食水等一般情况观察。接种14天后小鼠脱臼处死，分别称取小鼠体重，解剖瘤体、脾、胸腺，分别称重，个别组出现提早死亡的动物则提前解剖称重纪录。计算抑瘤率、瘤/体比、脾/体比、胸腺指数和脾指数等[2]。抑瘤率=(C-T) /C×100% T为实验组平均瘤重，C为对照组平均瘤重。胸腺指数=胸腺重/体重，脾脏指数=脾脏重/体重。
2.2血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)蛋白的测定
2.2.1标本提取接种14天后断颈脱臼处死荷瘤小鼠解剖瘤体，称重后置于4％多聚甲醛中固定24～48h，常规脱水，石蜡包埋，切片,留做免疫组化。
2.2.2VEGF bFGF免疫组织化学检测将组织切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯再浸泡10min，常规脱蜡，100％、95％、80％ 、70％酒精梯度水化，蒸馏水充分浸洗；3％H2O2室温下封闭30min以灭活内源性过氧化物酶，0.01M PBS(后同)洗10min，2次；滴加正常山羊血清封闭工作液，置湿盒中37℃孵育1h，甩去多余液体，勿洗；滴加适当稀释的VEGF抗体(工作浓度为1∶300)，置湿盒中37℃孵育1h，4 ℃过夜；复温至37℃ ，PBS洗10min，2次；滴加生物素标记山羊抗兔IgC，PBS洗10min，2次；DAB显色，70％、80％、95％、100％酒精依次梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。分别以抗体稀释液代替一抗作为阴性对照，在清晰的背景上出现特异性棕黄色颗粒者为阳性，在Motic显微镜下照相，应用计算机图像处理分析技术对免疫组化结果进行半定量分析，通过Motic Digilabii网络版数码显微镜互动教室进行彩色图文分析，测定免疫反应产物VEGF蛋白的平均光密度、积分光密度及平均灰度值，以备统计分析。
2.3病理组织学观察
随机取各组小鼠S180瘤块组织标本，经4%多聚甲醛固定24h，经常规脱水、透明、浸腊、包埋，切片HE染色，光镜下观察并拍照，并对各实验组肿瘤细胞种植部位侵袭程度进行组织学分级。
2.4统计学方法
各组数据用均数±标准差（±s）表示,应用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，组间比较采用多样本方差分析，两两比较采用t检验，P＜0.05为有统计学意义。
3结果
3.1各组小鼠抑瘤率对比
见表1。实验证明各组均有一定的抑瘤作用，以CTX组最为明显，抑瘤率达到51.69%；五叶草莓高、低剂量组抑瘤率分别为45.05%和37.77%（P0.05）,但CTX组P值较小，说明中药五叶草莓对胸腺及脾脏有一定的保护作用，对免疫器官影响小于CTX。
表2五叶草莓醇提物对S180荷瘤小鼠脾脏
指数与胸腺指数的影响（±s）
组别n胸腺指数脾脏指数CTX组101.36±0.36*▲4.82±0.89**▲WYCM高剂量组102.13±0.31☆☆ 6.84±1.01☆☆WYCM低剂量组10 2.00±0.59☆☆6.23±0.78☆☆模型组101.86±0.626.06±1.01空白组101.84±0.495.88±1.05注：*表示与模型组比较差异显著（P＜0.05）；**表示与模型组比较差异显著（P＜0.01）；☆表示与CTX组比较差异显著（P＜0.05）；☆☆表示与CTX组比较差异显著（P＜0.01）；▲表示与空白组比较差异显著（P＜0.05）。
3.3各组小鼠肿瘤细胞VEGF、bFGF表达水平的测定
灰度系指图像每一像素的明暗（深浅）程度，即该像素的图像由黑到白变化的量化等级。灰度值的大小与物质含量多少呈反比关系，灰度值越小，表示染色越深，所含物质的量越多。光密度又称吸光度，是指光线通过某一物质前与通过后光强度比值的对数值。光密度值与物质含量成正比关系，光密度值越小，说明光线被吸收的程度小，物质含量则越低[3]。
五叶草莓VEGF、bFGF蛋白在小鼠S180肉瘤组织中呈高表达，环磷酰胺及五叶草莓各剂量组可降低VEGF蛋白表达，其中VEGF与模型组相比有显著差异（P 表4五叶草莓醇提物对S180荷瘤小鼠
bFGF的影响（±s）
组别n阳性目标平均灰度阳性目标平均光密度阳性目标积分光密度CTX组10179.121±20.20**3.4×10-5±2.6×10-50.863±0.287**WYCM高10169.041±17.385*3.7×10-5±2.0×10-51.067±0.376*WYCM低10150.354±34.096☆4.7×10-5±3.3×10-51.344±0.848模型组10137.581±32.6885.3×10-5±4.1×10-51.584±0.510注：*表示与模型组比较差异显著（P＜0.05）；**表示与模型组比较差异显著（P＜0.01）；☆表示与CTX组比较差异显著（P＜0.05）。
3.4肿瘤组织切片HE染色观察
肉瘤组织经HE染色，镜下观察（见插页Ⅲ图1），可见肿瘤细胞侵犯肌层，瘤组织呈片状生长，肿瘤细胞密集排列，细胞大小不同，形态各异；细胞核大小不一，核质比例增大；染色质呈颗粒状，分布不均匀，可见不对称性，多极性核分裂等病理性核分裂象，瘤体周围有广泛水肿、出血，大量新生血管形成。环磷酰胺组有大片的细胞坏死区，较多新生血管形成。五叶草莓高、低组均可见到不同程度的片状坏死区，瘤组织内及其周围微血管均减少。
4讨论
在实体瘤的生长、浸润和转移中，持续的血管生成是一个关键因素。新生的微血管是肿瘤浸润和转移的第一站，肿瘤微血管数量越多，肿瘤细胞进入血液循环的机会就越大，转移概率越大。死亡的几率也会大大增加。血管新生指在原有的毛细血管和/或微静脉基础上通过血管内皮细胞迁移、增殖、黏附和形成管腔样结构等,最终形成有功能的新血管的过程[4]。恶性肿瘤生长经历两个阶段:血管前期和血管期。在血管前期,恶性肿瘤主要通过弥散作用获取氧气及营养。当恶性肿瘤生长到2mm3之后即处于血管期,其生长绝对依赖于血管新生,肿瘤组织之所以生长迅速易于转移，是因为不断产生的大量新生血管提供了丰富的血液供应[5]。通过抑制血管新生,进而抑制恶性肿瘤的生长已经成为目前肿瘤学研究的热点[6]，并为筛选抗肿瘤药物和探求其抗癌机理开辟了新的途径、新的思路。在众多与血管形成相关的因子中，肿瘤细胞自分泌的血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)是两个最主要促血管生成因子，在肿瘤中的表达常被作为评估抗肿瘤血管生成剂的重要指标。此二者通过与特异受体结合促进血管内皮细胞增殖、迁移，最终形成新生血管[7]。本实验通过对这两个指标的检测，探讨五叶草莓抑瘤可能的作用机制。通过实验我们得知：CTX组及五叶草莓高、低剂量组的抑瘤率分别为51.69%、45.05%、37.77%，提示环磷酰胺的抑瘤率最高，五叶草莓有一定的抑瘤作用。中药五叶草莓对胸腺及脾脏有一定的保护作用，对免疫器官影响小于CTX。我们用免疫组化法对各组小鼠肿瘤组织进行VEGF、bFGF蛋白表达的检测，结果显示：五叶草莓VEGF、bFGF蛋白在小鼠S180肉瘤组织中呈高表达，环磷酰胺及五叶草莓各剂量组可降低VEGF蛋白表达，其中VEGF与模型组相比有显著差异（P