摘要：目的:通过线栓法造成大鼠局灶性脑梗死，观察寒性药物?莶草提取物对大鼠脑梗死的保护作用。方法:将大鼠分为4组，分别为模型组，阳性药物尼莫地平12mg/kg组，假手术组，?莶草提取物7g生药/kg给药组。灌胃给药，观察药物对大鼠大脑中动脉阻断模型脑梗死面积、行为学指标、血清SOD, MDA含量等指标变化的影响。结果: ?莶草提取物可减小模型动物梗死面积，对行为学指标有一定的降低趋势、血清SOD, MDA含量等指标有一定的影响，但不具有统计学差异。结论：?莶草提取物对大鼠脑梗死可能具有一定的保护作用。
关键词：?莶草；大脑中动脉阻断；大鼠；保护作用
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0632-04
Protective Effect of Cold Medicine?Herba Siegesbeckiae Extraction on Rats of Cerebral Infraction
HAN Lei1,ZHANG Qing?juan2,XU Qin?feng3,ZHOU Xian?hui2
(1. Jiangsu Professional College，Nanjing 210036，Jiangsu，China；2.China Pharmaceutical University，Nanjing 211169，Jiangsu，China；
3. Liaoning University of TCM，Shenyang 110847，Liaoning，China)
Abstract:Objective: To discuss the protective effect of Herba Siegesbeckiae extraction on the rats of cerebral infraction. Methods：24 rats were randomly divided into 4 groups, that is sham-operation group, model group, Herba Siegesbeckiae extraction group and nimodipine control group. MCAO model was induced by a middle cerebral artery occlusion, preparation of 7g/kg Herba Siegesbeckiae extraction was given orally, and infarct area, ethological index, SOD and MDA in serum were observed. Results：Comparing with the model group, infarct area and ethological index in the Herba Siegesbeckiae extraction group tended to decrease, whereas there were no remarkable changes of SOD and MDA. Conclusion：7g/kg of Herba Siegesbeckiae orally has a protective tendency on MCAO rats.
Key words:Herba Siegesbeckiae；MCAO；rat；protective function
收稿日期：2011-10-22
基金项目：中国药科大学引进人才启动基金资助项目( 01211100)
作者简介：韩蕾（1975-），女，辽宁沈阳人，副教授，博士，研究方向：中药药性理论、中药药理学。
通讯作者：周晓辉（1971-），男，河北人，副教授，博士，研究方向：慢性前列腺炎的诊治与基础研究、中药药性理论。脑血管病目前是危害人群健康的主要疾病之一，现代医学认为，脑缺血时，在此过程中机体产生大量的氧自由基，而神经元的损伤、凋亡、坏死等均与活性氧引发的脂质过氧化密切相关，抗氧化剂可通过清除自由基、提高抗氧化酶等途径有效地阻断或防止这一过程。
脑缺血神经保护的疗效及其机理的研究，需要建立一个可重复的、稳定可靠的动物模型。大鼠具有与人类相似的脑血管结构，用大鼠制作的局灶性脑缺血模型与人类的脑梗死症状最为相似，线栓法制备大脑中动脉阻断(MCAO)模型具有不开颅、损伤小、效果肯定,且可以控制缺血与再灌注时间的特点，因此被研究者广泛使用[1]。
中医理论认为本病的发生与饮食不节、情志所伤、劳倦内伤、积损正衰等因素有关。其病位在脑，与心、肾、肝、脾密切相关。主要病机是肝肾亏虚，风阳上扰，兼夹痰瘀，阻闭清窍。肝肾亏虚为病之本，肝风痰瘀为病之标，多为本虚标实、上实下虚之证。故补益肝肾、熄风化痰、活血化瘀、开窍醒神为主要治法。
?莶草为常用中药，性寒，味辛、苦。始载于唐代《新修本草》。《中华人民共和国药典》(2005年版)收载，其来源为菊科植物稀莶Siegesbeckia orientalis L．、腺梗?莶Siegesbeckia pubescens Makino和毛梗?莶Siegesbeckiaglabrescens Makino 3种植物的地上部分，具有祛风湿、利关节、解毒之功效。?莶草中主要含有二萜类、倍半萜类、黄酮类等成分，药理学研究表明，?莶草在心血管系统、抗炎、抗病原微生物、免疫系统以及抗早孕方面均有良好的活性。?莶草传统用于治疗急慢性风湿性关节炎、腰腿疼痛等症。随着现代科学的发展和研究的日益深入，?莶草的临床应用范围也逐渐扩大，用于治疗的疾病可达十余种，尤其是在心血管方面，对高血压、冠心病、高胆固醇血症、脑血管意外后遗症、面神经瘫痪等均有较好的疗效。
本实验拟通过采用线栓法制作大鼠大脑中动脉阻断模型，在此基础上观察?莶草提取物的对脑梗死面积，行为学指标，SOD、MDA水平的影响，以评价其抗脑缺血作用，从而为其临床应用提供更多的药效学依据。
1动物分组和大鼠脑梗死模型的建立
1.1实验材料
1.1.1实验仪器常规手术器械。小型三用水箱：北京西城区医疗器械厂；80－2型离心机：上海手术器械厂；架盘药物天平：上海医疗器械八厂；电热恒温干燥箱：上海医疗器械七厂；7230分光光度计：上海分析仪器厂；旋涡振荡器：xw-80A,编号08，上海医科大学仪器厂生产；Leica照相机:S40-SLIDER；恒温振荡器：57590型，常州国华电器有限公司生产。
1.1.2药品与试剂?莶草提取物：药材购于同仁堂药房。500g?莶草经乙醇回流提取得到?莶草提取液700mL，使用时加入等体积蒸馏水，即得?莶草提取液。TTC(2,3,5-3苯基氯化四氮唑)：SCRC国药集团化学试剂有限公司。尼莫地平片：山西宝药业集团股份有限公司，每片含尼莫地平20mg。PBS缓冲液：磷酸二氢钠7.162g 磷酸氢二钠3.12g，分别加蒸馏水100mL前者取81mL,后者取19mL混合, 得1000mL pH 7.4，避光冷藏。乙醚：上海马陆制药厂生产。水合氯醛，上海曹杨第二中学化工厂生产，应用时以蒸馏水稀释至10%浓度。
1.1.3实验动物SD大鼠24只，雌雄兼用，体重180～250g，由中国药科大学实验动物中心提供。
1.2方法
1.2.1分组SD大鼠24只，随机分成4组，每组6只。分别为假手术组（只切开颈部皮肤，分离肌层但不插入线栓）、模型组（插入线栓但不给予药物）、中药提取物组（灌胃给予?莶草提取物7g生药/kg），阳性药物对照组（灌胃给予尼莫地平12mg／kg）,各给药组每天灌胃给药1次,给药体积为1mL/100g，假手术组和模型组给予等量生理盐水连续7天，第7天灌胃给药30min后制备模型，造模后不再给药干预。。其中需手术制作模型的实验组合称手术组。
1.2.2造模参照付宏亮等[2]的方法利用大脑中动脉线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。
（1）制作线栓4-0外科尼龙缝线剪成5cm长的短线，线头稍近火加热，使头端成光滑球即可，球体直径控制在栓线直径的1.5～2倍左右。完成后，距球端3cm作好标记，浸泡于肝素生理盐水中备用。
（2）将大鼠以10％水合氯醛(3mL/kg)腹腔注射麻醉后，手术过程右颈总动脉（CCA） 和颈外动脉（ECA）显露：采用颈部正中切口，暴露右侧胸锁乳突肌，分离肌肉组织，显露出CCA，由此间隙向上分离，找到CCA分叉，其中向内行走的为ECA，向外下行走的为颈内动脉（ICA）。结扎ECA，并在CCA近心端下方穿两根3-0丝线备用。栓线的放置［3］：在近分叉处夹闭CCA，并结扎CCA近心端，提取CCA，用眼科剪在距分叉处约1cm的血管壁上剪一小口，沿切口插入栓线，将预先放置在CCA切口远心端的丝线结扎，松开血管夹，继续送入栓线。当栓线送到分叉处，可轻微提取ECA，直视下将栓线送进ICA。距离分叉处约1.8～2.0cm，有阻力感，停止进入。缝合皮肤，将栓线尾端暴露在外。提拉栓线，当有阻力说明栓线头已达CCA切口，停止，剪去暴露在外的栓线，防止大鼠清醒时拉出栓线大出血死亡。术后注意保暖，大鼠麻醉清醒后2h进行行为学观察。
1.3结果
大鼠手术清醒后即出现了神经损伤症状，主要表现为提尾悬空时，左肩内旋，左前肢内收，肌力下降，行走时向左侧环转,缺血24 h时尤为明显，行为学评分均为2～4分。
1.4讨论
大鼠体重：大鼠体重与其MCA的粗细及长度呈正相关，MCAO模型制作时大鼠的体重与其线长也呈正相关，因此，体重因素在模型的制备中也颇为关键。体重>350g，颅内血管增粗，难以充分阻断MCA血流。
栓线的制备：在模型的制备过程中，栓线是提高模型成功率的关键，一般报告认为大鼠体重250～330g、线长17mm或18mm、栓线直径0.128mm，该方案制作的MCAO模型成功率高、重复性好、生理指标影响小，适合用于探讨脑梗死机理和评价药物疗效。
2?莶草提取物对大鼠行为学的改善和大鼠脑梗死面积的影响
2.1材料
2.1.1实验仪器常规手术器械。小型三用水箱：北京西城区医疗器械厂；恒温振荡器：57590型，常州国华电器有限公司生产；Leica照相机:S40-SLIDER。
2.1.2药品与试剂TTC(2,3,5-3苯基氯化四氮唑)：SCRC国药集团化学试剂有限公司。
2.2方法
2.2.1大鼠行为学结扎24h后将动物取出，进行行为学评分，采用5分制。
具体评分标准为：0分：无神经功能缺陷征；1分：一侧前肢部分屈曲；2分：一侧前肢完全屈曲；3分：向偏瘫侧转圈；4分：向偏瘫侧倾倒或不能自发行走，意识丧失。
2.2.2大脑梗死面积计算实验动物结扎24h后，断头取脑，-20℃冷冻10～15min，取出大脑,以0.2cm横向切成6片，置于磷酸盐缓冲液配制的2%TTC溶液中，37℃恒温孵育30 min，避光染色，正常大脑组织染色成黯红色，梗死处脑组织不着色，显示为白色。数码相机拍照后经图像分析软件分析梗死区面积,计算梗死区面积与大脑切片总面积的比值[3]。
2.3结果
2.3.1大鼠行为学结果?莶草提取物对大鼠行为学指标的影响[4]：大鼠手术清醒后即出现了神经损伤症状，主要表现为提尾悬空时，左肩内旋，左前肢内收，肌力下降，行走时向左侧环转,缺血24h时尤为明显，行为学评分均为2～4分。尼莫地平组与模型组相比可明显减轻神经损伤症状。?莶草组与模型组相比也表现出神经损伤症状的减轻。见表1。
2.3.2大鼠脑梗死面积结果缺血24h取材脑组织，肉眼可见阻塞侧大脑半球肿胀，体积明显增大于对侧。经TTC染色后，在梗死区大脑皮层及皮层下半球可见边界清晰、范围恒定的苍白梗死灶。
表1?莶草提取物对大鼠行为学
指标的影响(n=6，±s)组别剂量行为学评分假手术组-0模型对照组-3.5±0.8△△尼莫地平组12mg/kg2.5±1.6*?莶草组7g生药/kg2.7±1.6*注：△△与假手术组相比P 表3?莶草提取物对大鼠SOD活性及
MDA含量的影响(n=6，±s)组别剂量SOD (u/mL)MDA (nnol/mL)假手术组－210.05±14.233.13±1.01模型对照组－174.52±22.81△4.62±1.12△尼莫地平组12mg／kg194.53±4.54*3.17±1.26*?莶草组7g生药/kg177.03±9.354.95±1.31注：△与假手术组相比P