摘要：目的：检测未经治疗的慢性乙肝病毒（HBV）携带者瘀血阻络型和无症可辨型病毒反转录酶（Reverse transcriptase RT）区常见的核苷(酸)类似物（nucleoside analogue NA）12个耐药位点的基因序列，明确是否存在基因突变，明确两组不同中医证型的慢性HBV携带者在HBeAg水平、HBVDNA载量和基因突变方面是否存在差异。方法：选取慢性HBV携带者瘀血阻络型和无症可辨型各30例，检测血液乙肝三系定量，HBVDNA水平，并进行HBVRT区基因测序，chromas2.23软件分析核苷酸及氨基酸序列。结果：慢性HBV携带者瘀血阻络型HBeAg水平和HBVDNA载量低于无症可辨型，两组之间比较差异有统计学意义（t=2.268和3.908，P＜0.05）；瘀血阻络型有3例患者发生基因突变，突变类型：rtV173L +rtL180M+rtM204V、rtS213T和rtV214I；无症可辨型患者未检测到基因突变。结论：慢性HBV携带者瘀血阻络型病毒复制水平较低，在HBV RT区常见NA耐药位点存在基因突变，提示瘀血阻络型患者在NA抗病毒治疗前应进行基因测序，避免使用存在耐药风险的药物。
关键词： 肝炎病毒，乙型；突变；慢性乙肝病毒携带者；中医分型
中图分类号：R512.62文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0547-02
Research on Gene Mutation of Reverse Transcriptase Polymerase
in HBV Carriers with Virus of Blood?Stasis Type
WENG Wei?dong，LI Fang?qiong，JIANG Kai，ZHU Ying?hong
(Tongde hospital of Zhejiang province ,Hangzhou 310012,Zhejiang,China)
Abstract:Objective：To identify the untreated chronic HBV carriers with blood stasis type and asymptomatic patients HBV RT polymerase region common NA 12 resistance loci gene sequence. To investigate whether the presence of mutation and the different syndrome type of traditional Chinese medicine on the level of HBeAg and HBVDNA and common NA resistance loci gene mutations exist difference.Methods: Select chronic HBV carriers of blood stasis type and asymptomatic type 30 cases for each,hepatitis B antigen and antibody quantitative analysis and the levels of HBeAg were detected, Fluorescence quantitative PCR of serum HBVDNA levels were detected,and gene sequencing, Chromas 2.23 software was used for analysis of HBV RT gene mutation.Results:Chronic HBV carriers of blood stasis type HBeAg level and HBVDNA load below the asymptomatic sensible, between the two groups had significant difference（t=2.268、3.908，P＜0.05）, 3 cases were detected gene mutation in blood stasis type,mutation:rtV173L+rtL180M+rtM204V,rtS213T, rtV214I. Asymptomatic patients were not detected mutations.Conclusion:Viral replication level is low in blood stasis type,blood stasis type exists gene mutation in the HBV RT area common NA resistance loci.Blood stasis type patients should be tested gene sequencing before antiviral therapy and avoid using the drugs existing resistance mutations.
Key words:Hepatitis B virus;mutation;chronic HBV carrier; TCM syndrome
收稿日期：2011-10-10
基金项目：浙江省中医药管理局基金资助项目（2009WA008）
作者简介：翁卫东（1967-），女，福建顺昌人，副主任中医师，硕士，研究方向：肝病临床。慢性乙型肝炎患者多由慢性HBV携带者发展而来，NA是目前治疗HBV的常用药物，但治疗过程中的耐药性降低了其疗效甚至导致病情加重。将中医“治未病”理论应用于慢性HBV携带者的医学管理，在未治疗前对HBV RT区常见的NA耐药位点进行基因测序，明确是否存在基因突变，以及淤血阻络型和无症可辨型之间是否存在差异，指导日后的抗病毒治疗，避免抗病毒治疗过程中出现耐药和应答不佳。
1资料与方法
1.1一般资料2010年7月-2011年6月在浙江省立同德医院肝病门诊就诊的慢性HBV携带者，西医诊断参照我国2010年《慢性乙型肝炎防治指南》中慢性HBV携带者的诊断标准［1］，中医诊断参照1992年病毒性肝炎中医辨证标准［2］。选择瘀血阻络型患者30例，男22例,女8例,年龄(40.6±13.6 )岁,病程(11.9±4.94)年；另选无症状患者30例作对照，男20例,女10例,年龄(38.5±11.8)岁,病程(10.84±3.43)年，两组患者在性别、年龄、病程方面差异无统计学意义(P>0.05)。
1.2入选标准血清HBsAg和HBeAg阳性半年以上，HBVDNA定量≥ 103拷贝／mL，1年内连续随访3次以上，血清ALT和AST均在正常范围，未经与乙肝有关的药物治疗。瘀血阻络证临床表现：主症：①面色晦黯，或赤缕红丝，②胁下痞块；次症：①舌质黯或有瘀斑；②朱砂掌，蜘蛛痣；③两胁刺痛；④女子行经腹痛或经色黯红有块。辨证要求：（1）具备所有主症者，即属本证；（2）具备主症及次症各1项者即属本证；（3）具备次症中的3项即属本证。
1.3排除标准血清ALT持续或反复升高；合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒；合并酒精性、药物性、自身免疫性、脂肪性肝病；有NA等抗病毒药物治疗史的患者均予以排除。
1.4标本采集采集患者空腹静脉血，分离血清， -20℃冰箱保存备检。
1.5试剂与仪器ABI3130基因分析仪，ABI 7000荧光定量PCR仪， ABI Veriti普通PCR仪，IMx型抗原抗体定量分析仪，上海申友乙型肝炎病毒及耐药突变检测试剂盒。
1.6PCR扩增及基因测序血清标本采用Qiagen公司的试剂盒抽提血清HBV DNA，采用PCR法扩增HBV P基因的RT区，引物序列如下：上游引物5’一TAT GTT TCC CTC TTG TTG CTG一3’；下游引物5’一CTT CCA ATT ACA TAT CCC ATG-3’具体方法如下：第1轮PCR反应体积为40ul,取36ulHBV荧光定量PCR反应液和Taq酶混合物，加入4ulHBV裂解产物，按以下扩增条件进行扩增：42℃ 5min，94℃ 5min；94℃ 5s，60℃ 40s，30个循环；37℃保存。取第1轮PCR产物1μL，加2μL sap试剂，酶解60min,取产物3μL加测序试剂2μL进行第2轮扩增：96℃ 1min；96℃ 10s，50℃ 5s，60℃ 4min 25个循环；4℃保存。扩增产物纯化后进行序列测定。
1.7核苷酸及氨基酸序列分析采用Chromas 2.23软件进行分析。
1.8统计方法采用SPSS 13.0统计软件，计量资料用±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1两组患者HBeAg和HBVDNA水平的比较见表1。慢性HBV携带者瘀血阻络组HBeAg水平和HBVDNA载量均低于无症可辨组，两组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。
表1两组患者HBeAg 和HBVDNA水平的比较
组别例数HBeAg(S/CO)HBVDNA(cops/mL)瘀血阻络组30732.3±197.8*6.2±0.82*无症可辨组30825.6±246.77.8±0.64注: 瘀血阻络组与无症可辨组比较， t =2.268和3.908 ，*P