【摘要】目的 探讨低中剂量乙醇对培养大鼠心室肌细胞ALDH2表达的影响；方法 利用原代培养新生大鼠心室肌细胞，用不同浓度乙醇进行处理，利用缺氧试剂盒制备心肌细胞缺氧模型，通过流式细胞仪检测乙醇干预后心肌细胞凋亡变化。采用免疫荧光技术检测ALDH2表达。结果 新生大鼠心肌细胞原代培养纯度达90%以上，流式细胞仪检测结果显示：低中剂量范围内乙醇浓度和缺氧诱导心肌细胞凋亡之间呈现一种U型关系。结论 在低中剂量范围内，乙醇剂量与缺氧诱导心肌细胞凋亡之间呈U型关系。低中剂量乙醇可能是或至少部分是通过上调ALDH2，抑制心肌细胞凋亡发挥心肌保护作用。
【关键词】ALDH2 心肌细胞 乙醇 细胞凋亡
中图分类号：Q554.07 文献标识码：B 文章编号：1005-0515（2012）3-073-03
【Abstract】Objective To investigate the low dose of ethanol on cultured rat ventricular myocytes ALDH2 expression; Method using primary cultured neonatal rat ventricular myocytes, treated with different concentrations of ethanol, the use of oxygen preparation kit model of myocardial hypoxia, ethanol by flow cytometry after the intervention changes in myocardial apoptosis. Immunofluorescence detection of ALDH2 expression. Results of neonatal rat cardiac cells in primary culture for more than 90% purity by flow cytometry showed that: in the low dose range of ethanol concentration and hypoxia-induced apoptosis in cardiac myocytes showed a U-shaped relationship between. Conclusion In the low dose range, dose of ethanol and hypoxia-induced cardiomyocyte apoptosis between the U-shaped relationship. Low dose of ethanol may be increased or at least in part by ALDH2, inhibition of cardiomyocyte apoptosis play a role in myocardial protection.
【Keywords】ALDH2; myocardial cells; ethanol; apoptosis
随着人民生活水平的提高，日常生活中饮酒越来越普遍。酗酒对机体产生很大的影响，造成广泛的代谢紊乱和器官功能损伤。长时间酗酒能明显增加肝脏疾病、心脏疾病、消化性溃疡、出生缺陷和脑损伤等。另一方面，大量流行病学和临床调查显示低中剂量饮酒能够降低冠心病发病率和死亡率[1]。低中剂量乙醇能否通过影响ALDH2表达发挥心肌保护作用；未见文献报道。本文拟通过低中剂量乙醇对培养大鼠心肌细胞ALDH2的影响作用，为适量饮酒具有心肌保护作用提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料 实验动物选择出生12-24小时SD大鼠20只，雌雄不限（河南大学实验动物中心提供）；胎牛血清（军事医学科学院产品）；DMEM高糖培养基和胰蛋白酶（Sigm产品），Ⅰ型胶原酶和透明酸酶（Gibico产品）；5溴-2脱氧尿苷（5/-Bromo-2/-deoxyuridine, Brdu）
1.2 实验方法
1.2.1 心肌细胞培养和免疫荧光鉴定心肌细胞
1.2.1.1 心肌细胞培养 无菌条件下开胸取出心脏，剪去心室肌组织，将心房肌组织剪成体积约0.5mm3的小块，机械清洗，弃上清液。在沉淀组织加入0.1%胰蛋白酶、透明酸酶和0.1%胶原酶各3ml，置入37.0℃水浴箱中，用机械吹打进行消化分离5min，收集上清加入等量的含10%胎牛血清(fetal bovine serum FBS )培养液以终止消化，重复数次直到组织块消失，将上述上清收集离心（1000r/min,10min）,弃去上清，加入含20%FBS 的培养液3ml制成细胞悬液，置入培养瓶中，放入培养箱（37.0℃，5%CO2）进行培养。60min后将培养瓶中的上清移入另一培养瓶，重复两次后取上清液再次离心(1000r/min,10min)，加入20%FBS 的DMEM制成细胞悬液，细胞计数，调整浓度为1x106个/L，取培养皿36个，分别放入处理过的雪盖片1个，在雪盖片上各加入上述细胞悬液0.2ml，1hr后，再各加入含20%FBS 及0.1mmol/L Brdu的DMEM高糖培养液2.5ml，充分混合后放入培养箱进行培养，备用。
1.2.2 不同浓度乙醇干预心肌细胞缺氧处理 细胞培养48 h，换成无血清培养基培养12 h，细胞同步化；用PBS冲洗两遍，分别加入乙醇浓度为5，10，15，20，30 mmol/L的培养基，继续12 h；吸出含乙醇的培养液，加入含0.2% FBS DMEM培养过夜；将细胞、缺氧发生剂和缺氧指示条放入Genebox盖紧盖子，当缺氧指示条提示缺氧后（大约30 min）开始计时，缺氧2.5 h。
1.2.3 心肌细胞爬片免疫荧光和ALDH2的检测 所有标本均按如下方法进行：除去细胞培养液，PBS冲洗细胞3遍；4%多聚甲醛室温固定15 min；PBS冲洗两遍；0.2% Triton x-100透膜，室温30 min；PBS冲洗两遍；1%山羊非免疫血清封闭，室温1 h或37℃ 30min；甩去血清，加入山羊抗大鼠ALDH2抗体（1:50）40 μl，4℃，过夜；PBS冲洗3次；加入FITC标记的兔抗山羊IgG （1:100） 40μl，室温2 h；PBS冲洗3次；DAPI（1:5000）40 μl，室 温，3 min；PBS冲洗3次；50%甘油封片；荧光显微镜下观察拍照。利用图像分析软件计算积分光密度（intergated optional density，IOD）。
1.2.4 TUNEL法检测细胞凋亡 除去细胞培养液，PBS冲洗3遍；4%多聚甲醛室温固定15 min；PBS冲洗 5 min×3；0.1% Triton x-100透膜，4℃ 2 min；PBS冲洗 5 min×3；每张片加TUNEL reaction mixture 50 μl （50 μl Enzyme solution加450 μl Label solution），在湿盒中37℃孵育60 min；PBS冲洗 5 min×3；加converter-POD 50μl，37℃孵育30 min；PBS冲洗5 min×3；加DAB显色液（1ml ddH2O加A、B、C试剂各1滴）50 μl，室温显微镜下控制显色；PBS冲洗 5 min×3；苏木素复染，常规复水、透明和封片。显微镜下每张片随机取6个视野拍照。计算凋亡阳性细胞数和阴性细胞数，计算凋亡率（阳性细胞数与总细胞数比值）。
1.2.5 统计分析
图片应用Image Pro Plus 6.0软件进行图像分析；应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，所有数据均用平均值 标准差（means SD）表示，以 α = 0.05为检验水准，P＜0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 免疫荧光心肌细胞鉴定
胰酶分次消化分离心肌细胞，未贴壁时为圆形或椭圆形，24 h后可见心肌细胞贴壁，伸展成为长杆形、多角形、梭形或不规则三角形等形态，核呈卵圆形并居中，胞体有明显的折光性，立体感强，并有个别心肌细胞非同步化跳动。48~72 h各细胞突起呈分枝相连成簇状或片状，并可见心肌细胞同步化搏动。经α-MHC单抗组化染色鉴定，心肌细胞纯度达90 %以上（图1）。
2.2 不同浓度乙醇干预对缺氧诱导心肌细胞凋亡的流式细胞检测
不同乙醇浓度干预心肌细胞后给予缺氧诱导凋亡，检测结果显示：乙醇对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的作用呈剂量依赖性；与未干预组相比，5 mmol/L和10 mmol/L组凋亡（包括早晚期）明显降低（0.227 ± 0.058，0.194 ± 0.075 vs. 0.375 ± 0.107），并有显著性差异（P = 0.049，0.020），15 mmol/L，20 mmol/L，30 mmol/L组和对照组相比没有明显差异（0.264 ± 0.073，0.313 ± 0.051，0.362 ± 0.114；P＞0.05）（图2）。
2.3 不同浓度乙醇干预心肌细胞ALDH2表达变化
心肌细胞免疫荧光结果显示：在低中剂量范围内，ALDH2蛋白表达随乙醇浓度增加有升高趋势（图3，4）。
3 讨论
低中剂量饮酒定义为男性每人每天2杯，女性1杯（常规啤酒355 ml，白酒118 ml，蒸馏酒44 ml，日本米酒113 ml定义为1杯[2]），就绝对量而言乙醇的量为 [7] Kannel WB, Ellison RC, Alcohol and coronary heart disease: the evidence for a protective effect [J].Clin Chim Acta, 1996,246 (1-2): 59-76.
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