摘要：目的：观察眼针对脑缺血再灌注损伤大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和脑源性神经营养因子(BDNF)含量的影响，探讨眼针治疗脑缺血再灌注损伤的机制。方法：应用线栓法复制脑缺血再灌注损伤大鼠模型，采用眼针治疗，于再灌注后3、24、72h进行神经功能缺损评分，采用化学比色法测定大鼠血清SOD、MDA含量的变化。采用ELISA方法检测血中BDNF含量的变化。结果：与模型组比较，眼针组大鼠神经功能缺损评分明显下降，大鼠血清SOD含量增多，MDA含量减少，BDNF含量增多（P＜0.05）。结论：眼针具有明显改善大鼠脑缺血再灌注损伤的作用，其机制与大鼠血清SOD、MDA及BDNF变化有关。
关键词：眼针；脑缺血再灌注损伤；超氧化物歧化酶；丙二醛；脑源性神经营养因子
中图分类号：R245.329文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0486-03
Effect of Eye Acupuncture Therapy on the Levels of Serum SOD and MDA
in Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion Injury
JIA Xiao?jie1, XIE Xin2, WANG Zhe2, WANG De?shan2
(1.Shenhe District Chinese Medcine Hospital,Shenyang 110013,Liaoning,China;
2.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847,Liaoning,China)
Abstract:Objective：To investigate the effect of the eye acupuncture therapy on the levels of serum SOD,MDA and BDNF in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury and the related mechanism. Methods：To establish the rat model of cerebral ischemia-reperfusion by suture method. The serum levels of SOD and MDA were measured by the chemical colorimetry.The method of ELISA was taken to detect the change of the BDNF levels. Results：Compared with the model group, the neurologic impairment score of the eye-acupuncture group reduced obviously. The serum levels of SOD and BDNF increasaed and those of MDA decreased in the eye-acupuncture group（P＜0.05）.Conclusion：The eye acupuncture therapy played a role in improving cerebral ischemia-reperfusion injury evidently and the mechanism was related to the alteration of serum SOD, MDA and BDNF levels.省略。眼针疗法是我校彭静山教授于70年代始创[1]，依据中医眼科“五轮八廓”理论并结合“八卦”学说将眼眶周围划分为“八区十三穴”并将其与五脏六腑以及上、中、下焦相通联，以穴区为针刺点达到防治疾病的一种微针疗法。30余年逾百万计病例证明，眼针对多种疾病均有疗效[2-3]，特别是对脑缺血致残性疾病损伤动物模型，观察眼针治疗对大鼠神经功能损伤效果突出[4-5]。本研究通过建立大鼠脑缺血再灌注大鼠模型，观察眼针对BDNF的影响，以及血清中SOD活力、MDA含量的变化,探讨眼针对脑缺血再灌注损伤作用机制，为临床眼针治疗CIRI提供依据。
1材料与方法
1.1实验动物与分组健康SD雄性大鼠90只，体重（200±20）g，由中国医科大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为10组，分别为正常组、3h假手术组、3h模型组、3h眼针组，24h假手术组、24h模型组、24h眼针组，72h假手术组、72h模型组、72h眼针组，每组9只。
1.2模型制备与评价各时间点模型组及眼针组均采用改良的线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型,模型复制参照文献[6]。模型成功标准：大鼠在缺血2h后再灌注，再灌注后立即进行神经功能缺损评分，评分为1～3分者纳入实验组，未达标准者排除。参照ZeaLonga 5分制评分标准[7]:0分为无症状；1分为不能完全伸展对侧前爪；2分为向对侧转圈；3分为向对侧倾倒；4分为不能自发行走，意识丧失。假手术组术式同模型、眼针组，区别在于钓鱼线插入深度为0.5～1cm。正常组未处理。
1.3眼针取穴及刺法眼针组：用13mm毫针，于大鼠眶周2mm处针刺，定位参照人体取穴方法[1]，取肝区、上焦区、下焦区、肾区，见图1。通过触摸大鼠眼周，确定眼眶眶缘的位置，并在标记好的穴区部位，眼眶眶缘上1～2mm部位，采用斜刺方法进行针刺，具体方法：左眼按照顺时针方向（右侧按逆时针方向），从该穴区的起始定位线处斜向下45°角向终止定位线方向进针，刺入真皮，达到皮下组织，进针2mm左右。留针20min，留针期间进行刮柄刺激，在留针10min时，采用刮柄法行针1次，刮针柄5下，以加强刺激。20min后出针，以刺手的拇、食指捏持针柄，轻轻转动后缓慢出针。治疗时机：3h针刺组于脑缺血再灌注即刻及处死前30min，分别进行眼针治疗。除此之外，24h、72h每隔12h分别治疗1次。正常组、假手术组和模型组无其它处理。
1.4指标测定眼针结束后，麻醉状态下腹主动脉取血5mL，离心分离血清备用；采用化学比色法测定大鼠血清SOD、MDA含量的变化: MDA采用硫代巴比妥酸法测定;SOD采用黄嘌呤氧化酶法。试剂均采用北京军事生物工程研究所的试剂盒。操作步骤严格按照说明书进行。仪器采用上海产721型分光光度计。采用ELISA方法检测大鼠血清BDNF含量，试剂盒为美国R&D公司进口分装试剂盒，按照试剂盒说明书进行检测。利用全自动酶标仪，在450nm处测定各孔的OD值，采用CurveExpert 1.3进行标准曲线的绘制，并计算出对应的浓度值。
1.5统计学处理采用SPSS 11.5统计软件分析，实验数据均采用（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05被认为有显著性差异。
2结果
2.1眼针对CIRI模型大鼠神经功能缺损评分的影响模型组和眼针组大鼠均出现不同程度的神经功能障碍,如提尾时左侧前肢不能伸直, 行走向对侧旋转或倾倒等; 假手术组大鼠无神经功能障碍表现。眼针治疗后，眼针组大鼠脑缺血再灌注损伤3、24、72h后，神经功能缺损程度较模型组呈现不同程度降低，均有显著差异（P＜0.01），见表1。
表1眼针对CIRI模型大鼠
神经功能缺损评分的影响 （评分）组别n造膜后3h造膜后24h造膜后72h正常组
假手术组
模型组
眼针组9
9
9
90
0
2.625±0.916
11.500±0.5345**0
0
3.125±0.6409△
1.500±0.5345**0
0
2.625±0.7440
1.625±0.5175**注：与模型组比较，**P＜0.01。
2.2眼针对CIRI模型大鼠血清中SOD含量的影响大鼠血清SOD含量结果：模型组大鼠血清中SOD含量明显低于正常组和假手术组；眼针组大鼠血清中SOD含量明显高于模型组，均有显著差异（P＜0.01），见表2。
表2眼针对CIRI模型大鼠血清中
SOD含量的影响（U?mL-1）组别n3h24h72h正常组
假手术组
模型组
眼针组9
9
9
9179.91±8.86
154.18±23.96
117.37±8.29
138.31±13.58**179.91±8.86
150.26±14.52
113.86±8.16
129.27±12.02**179.91±8.86
146.8±19.13
96.06±9.30
125.37±13.88**注：与模型组比较，**P＜0.01。
2.3眼针对CIRI模型大鼠血清中MDA含量的影响检测结果显示：模型组大鼠血清中MDA含量明显高于正常组和假手术组；眼针治疗后含量低于模型组，有显著差异（P＜0.01），见表3。
表3眼针对CIRI模型大鼠血清中
MDA含量的影响（nmol?mL - 1）
组别n3h 24h72h正常组
假手术组
模型组
眼针组9
9
9
93.61±0.60
4.42±0.89
12.91±1.15
5.56±1.26**3.61±0.60
4.07±0.85
11.68±1.20
5.51±0.79**3.61±0.60
4.04±0.62
11.58±1.15
5.37±0.67**注：与模型组比较， **P＜0.01。
2.4眼针对CIRI模型大鼠血清BDNF含量的影响ELISA方法检测大鼠血清BDNF表达结果：模型组大鼠血清中BDNF表达明显低于正常组和假手术组，治疗后眼针组大鼠血清中BDNF表达明显高于模型组，均有显著差异（P＜0.01），见表4。
表4眼针对CIRI模型大鼠血清中
BDNF含量的影响（pg/mL）组别n3h24h72h正常组9869.24 ±197.716869.24±197.71869.24±197.71假手术组939.92±86.283683.45±67.67706.00±39.46模型组910.48±87.54315.90±64.67342.20±80.18眼针组9406.36±96.25**519.00±84.84**622.26±93.14**注：与模型组比较，**P＜0.01。
3讨论
随着我国逐渐步入人口老龄化社会,脑血管疾病已经成为一个倍受社会关注的问题。在我国，脑血管疾病死亡率仅次于恶性肿瘤,是对人类健康威胁十分严重的一类疾病，脑缺血是脑血管疾病最主要的疾病之一,所以在临床上如何减轻脑组织的损伤、保护神经细胞免受损伤等问题成为研究的热点。
兴奋性氨基酸的毒性、Ca2 +内流、自由基损伤等是缺血再灌注损伤级联反应的主要病理生理学机制。自由基可使细胞中的蛋白质、核酸等大分子物质发生交联反应,损害生物膜,影响细胞的正常功能。MDA是脂质代谢的产物，含量多少间接反映脑组织中氧自由基含量的变化、脂质过氧化程度以及脑组织细胞损伤的程度；正常机体内存在抗氧化系统，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶，可相互协调清除自由基,减少脂质过氧化物的产生，使人体内自由基的生成和清除处于动态平衡。BDNF是脑神经营养因子之一,是神经元成熟、分化、存活和功能活动的必需多肽类因子。SOD可以通过清除自由基，减少脑内MDA含量同时增加BDNF的含量，促进神经元成熟、分化、存活。有研究显示BDNF在脑缺血再灌注缺血周边区神经元的损伤修复中发挥了重要作用[8-9]。在缺血再灌注损伤时,机体可以产生大量的自由基,不能正常清除，自由基可通过氧化反应造成细胞膜磷脂分子中的不饱和脂肪酸过氧化，产生的脂质过氧化物经过氧化酶催化生成MDA，MDA使磷脂结构发生变化,膜受到严重损伤,导致组织的损伤[10-11]以及神经细
收稿日期：2011-10-26
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30973780）;浙江省自然科学基金资助项目（Y2080273）
作者简介：胡海燕（1963-），女，浙江桐庐人，副教授，硕士，研究方向：老年痴呆症中医药防治的临床与科研。胞功能受到严重影响[12]。
本实验中模型组大鼠在脑缺血再灌注损伤后，出现神经功能缺损症状，同时伴有血清中SOD含量较正常组降低、MDA含量较正常组升高、BDNF含量较正常组降低，表明脑缺血再灌注后，机体内自由基的生成增加，SOD的含量降低，同时脂质代谢产物MDA的含量增多，导致BDNF含量减少进而加重脑组织的损伤，致使大鼠出现神经功能缺损的症状，如提尾时左侧前肢不能伸直, 行走向对侧旋转或倾倒等。眼针组大鼠神经功能缺损程度减轻，同时血清中SOD含量较模型组升高，MDA含量比模型组降低，BDNF含量升高。说明应用眼针治疗方法，可通过增加脑缺血再灌注损伤大鼠血清中SOD含量，来清除更多的自由基，使脂质代谢产物MDA的生成减少, BDNF含量增加来达到减轻大鼠神经功能缺损的目的。
本研究结果表明眼针可能通过抑制自由基氧化作用的相关途径，来提高神经营养因子对损伤神经元的修复，发挥眼针抗脑缺血再灌注损伤的功能和疗效。
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