摘要：目的：选用荷瘤小鼠作为研究对象，观察大黄虫丸对肿瘤细胞的抑瘤和诱导凋亡作用，旨在探讨大黄虫丸抗肿瘤效应机制，为其临床应用和创制新药提供理论依据。方法：建立小鼠克洛氏（S180）肉瘤动物模型，以大黄虫丸方82g/kg剂量连续灌胃10天，同时设模型对照组、正常组和西药（环磷酰胺）对照组，取治疗组、对照组及模型组实体瘤分别涂片观察肿瘤细胞中Survinvin的表达。结果：与模型对照组及西药（环磷酰胺）对照组比较，大黄虫丸治疗组肿瘤组织中Survinvin的表达明显降低。结论：大黄虫丸能够调低肿瘤细胞中Survinvin的表达，诱导肿瘤的凋亡。
关键词：大黄虫丸；肿瘤；凋亡 Survinvin
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0462-02
Effect of Dahuang Zhechong Pill on Survinvin Expression in S180 Tumor Cell
AI Hua,TIAN Xiao?huan
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847，Liaoning，China)
Abstract:Obejective：Using tumor-bearing mice as targets, we investigate the inhibitory and apoptosis-inducing effects on tumor cell of Dahuang Zhechong Pill to study its anti-tumor effect mechanism, and to provide theoretical basis for its clinical and pharmaceutical applications.Methods：After building a mice bearing S180 sarcoma model, we carry out oral tests in mice in an 82g/kg dose for 10 days. A model control group and a cyclophosphamide control group have also been built. The survinvin expressions in cancer cells for all groups have been observed by smear tests of tumors. Results：Dahuang Zhechong Pill group has much more significant inhibitory effect on survinvin expression compared with the model control group as well as cyclophosphamide control group.Conclusion:Dahuang Zhechong Pill can inhibit the survinvin expression in cancer cell and induce tumor apoptosis.
Key words:Dahuang Zhechong Pill; tumor; apoptosis; survinvin
收稿日期：2011-10-30
基金项目：辽宁省教育厅资助项目（200908）
作者简介：艾华（1955-），男，辽宁沈阳人，教授，博士研究生导师，研究方向：《金匮要略》的教学与临床。大黄虫丸出自《金匮要略?血痹虚劳病脉证并治第六》：“五劳虚极羸瘦，腹满不能饮食，食伤、忧伤、饮伤、房室伤、饥伤、劳伤、经络营卫气伤，内有干血，肌肤甲错，两目黯黑，缓中补虚，大黄虫丸主之。”是汉代名医张仲景为“虚劳干血”所创立的一首活血消?的方剂，“虚劳干血”相当于现代医学所称之肿瘤，千百年来众多医家广泛用此方治疗各种瘀血性疾病，取得了很好的效果，特别应用于肿瘤的治疗。我们以荷瘤动物为对象，观察大黄虫丸对S180肉瘤的作用，从肿瘤细胞中Survinvin的表达方面进行研究，现报道如下。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1药物制备（1）药物：大黄虫丸组成：熟大黄12g，黄芩10g，甘草15g，桃仁20g，杏仁15g，白芍20g，熟地50g，干漆10g，虻虫15g，水蛭50g，蛴螬15g，蜇虫15g，白蜜5g，白酒10g（以上药物由辽宁中医药大学附属医院中药房一次性购买，生药鉴定为真品）。通过公式1换算，得大黄虫丸用于小鼠的计量41g/（kg?d），以本剂量的二倍剂量作为高剂量给药。环磷酰胺为山西普德药业有限公司产品，批号：20090801。公式1：B种动物的剂量（mg/kg）=W×A种动物的剂量（mg/kg）[1]。
（2）中药配制：大黄虫丸按照中药常规煎法进行煎煮，既煎煮前先用凉水浸泡30min，用水量约为生药量的8倍，煎至半小时，然后过滤出药液，加6倍量的水再煮沸15min，滤出药液，将两次药液合并，置于4℃冰箱保存备用。
1.1.2实验动物健康昆明种小鼠55只，4～6周龄，体重18～22g，雌雄各半，由辽宁中医药大学动物实验中心提供。
1.1.3瘤株腹水型克洛氏肉瘤（S180）瘤株由中国医科大学提供。
1.2实验方法
1.2.1造模方法无菌条件下，抽取S180瘤株小鼠乳白色浓稠腹水（若为黄色或红色则应该弃去不用），腹腔接种4～5只小鼠，7天后抽取接种小鼠腹水，方法与前相同，细胞计数板计数后，用无菌生理盐水1∶1稀释，经0.2%胎盼蓝染色，细胞计数板计数后，计算活细胞数>95%，调整瘤细胞悬液数约为1×106/mL，再分别给45只体重小鼠前肢左侧腋下部皮下处接种该稀释后的瘤细胞悬液0.2mL，全部制成S180荷瘤小鼠模型，然后称重分组。
1.2.2动物分组及给药方法将45只接种瘤细胞的小鼠随机分为3组，每组15只，雌雄分笼饲养。（1）模型组：每只小鼠用生理盐水灌胃0.02mL/（g?d）；（2）西药（环磷酰胺）对照组：每只小鼠腹腔注射环磷酰胺20mg/（kg?d）；[2]（3）大黄虫丸组每只小鼠药物灌胃0.02mL/（g?d），连续10天。另设10只小鼠为正常组，未加任何药物，每天正常饲养。
1.2.3标本采集停药次日，各组小鼠脱颈处死，剥离荷瘤小鼠的肿瘤组织，剔除干净周围结缔组织。
1.3指标检测
采用免疫组织化学SABC法，主要步骤如下：切片常规脱蜡至水，3% H2O2室温10min以阻断内源性过氧化物酶，行微波热修复抗原，冷却后滴加5%BSA溶液，室温20min，加入兔抗人Survivin多克隆抗体(稀释度均为1∶100)，4℃过夜，滴加生物素化二抗，室温20min，滴加SABC试剂，室温20min，DAB显色，镜下控制显色时间，苏木素轻度复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。采用已知的阳性片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照[2]。Survivin表达判定标准：Survivin染色定位于胞浆，呈棕黄色，见插页Ⅰ图1。采用颜色对比分析，切片根据阳性细胞百分率分为：阳性(+)，随机计数5个视野，计算每个视野阳性细胞率，取平均值，如大于10%则为阳性；阴性(-)，没有或仅有弱的染色，阳性细胞率 2结果
2.1模型组
切片组织中可见大量棕黄色肿瘤细胞，其Survivin表达阳性细胞率为90%以上，见插页Ⅰ图2。
2.2西药（环磷酰胺）对照组
切片组织中可见少量棕黄色肿瘤细胞，其Survivin表达阳性细胞率为20%，见插页Ⅰ图3。
大黄虫丸治疗组：切片组织中可见许多空泡样改变和为数不多的棕黄色肿瘤细胞，其Survivin表达阳性细胞率仅为10%，见插页Ⅰ图4。
综合以上观察结果可以发现，模型组的肿瘤组织切片中Survivin高表达，大黄虫丸和环磷酰胺均能够调低肿瘤细胞中Survivin表达，其中大黄虫丸组的肿瘤组织切片中仅有少量棕黄色细胞，表明对调低Survivin表达有显著作用。
3讨论
肿瘤的发生与组织中许多原癌基因和抑癌基因的调控失常导致细胞分化和增值的异常与肿瘤的发生有着密切关系。因此，对肿瘤的治疗需从多方面多角度着手，可通过直接杀伤肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞凋亡，调低肿瘤细胞内抑制凋亡基因的表达等手段，达到治愈肿瘤的目的。细胞凋亡或程序化死亡，是指细胞在内外界凋亡诱导因素作用下，遵循自身的程序结束自己生命的过程[4]。Survivin是IAP基因家族的新成员，是经效应蛋白酶受体-1（EPR-1）cDNA从人类基因组库的杂交筛选中分离出来的，属于防止细胞自我破坏（即凋亡）的蛋白质[5]。Survivin基因蛋白在大多数肿瘤中表达而在成人正常组织不表达或低表达，本实验通过这一特征，对各组肿瘤组织中Survivin表达进行测定，结果表明大黄虫丸能够调低肿瘤组织中Survivin表达，证明大黄虫丸能够有效诱导肿瘤细胞凋亡的发生，产生抑瘤作用，其抗癌抑瘤作用可能与调低Survivin表达有直接关系。《金匮要略》所载“虚劳干血”相当于现代的肿瘤，仲景原文指出“五劳、七伤”是“干血”形成的重要原因，其主症表现为“内有干血，肌肤甲错，两目黯黑。”大黄虫丸正是针对于“虚劳干血”之证所创立的方剂。从大黄虫丸立方角度来看，其方君药大黄具有泻下攻积、活血祛瘀、清热泻火之功，又应用虫类药及干漆破?瘕积聚类药物，虫类药物的特点是善于走行，干漆通经破瘕，极善除经络之瘀血，于瘀积日久所成之干血，有消散涤荡之功；又加入了黄芩、杏仁以增调畅气机，清热泻火宣肺而解郁热之功；更应用地黄、甘草、芍药之品用以扶正补虚，养血又兼顾补益脾胃，使攻伐虽剧而不致伤正。方中破瘀荡涤之药虽药味甚多，但药量较微，补益之品虽寡，然药量较重。由此可以看出本方真正做到了补虚扶正兼顾，攻中寓补，缓和补虚的特点，使攻伐“干血”时，“虚劳”得以纠正，正气亦得以恢复。通过上述大黄虫丸药物组成、中医和现代医学理论对肿瘤病因病机辨证论治的观点，综合全方具有活血化瘀、破?散瘕、扶正补虚的功效，所以能够在肿瘤的治疗过程中起到抑制肿瘤生长、促进机体正气恢复增强机体免疫功能的作用。
参考文献
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