【摘要】 目的 为了获得党参及四君子汤作用于小鼠神经元的蛋白质组表达模式。方法 原代培养小鼠神经元，随机分为三组，即党参组、四君子汤组和空白对照组，药物作用20min后，裂解细胞并提取全细胞蛋白，双向电泳分离，银染，ImageMaster 2D Platinum软件进行差异蛋白质组分析，EPCLUST软件进行基于相关性的平均距离树状分层聚类。结果 在小鼠神经元双向电泳图谱上共检获并匹配差异表达蛋白质斑点共计414个，其蛋白质组表达模式表现为五大类型，即全抑制型、党参单一抑制型、双向调控型、全激活型和四君子汤单一激活型。结论 党参及四君子汤作用于小鼠神经元的蛋白质组表达模式呈现一定的特征性，这种表达模式及其特征性的改变可应用于相关中药药理作用的评价中。?
【关键词】 蛋白质组表达模式； 树状分层聚类 ；党参； 四君子汤 ；小鼠神经元?
【中国分类号】 R282.5【文献标识码】 A【文章编号】 1044-5511（2012）02-0097-01??
中医中药是祖国医学的宝贵遗产, 在中国医学史上发挥了巨大的作用。但由于中药，特别是组方药的化学成份复杂，其有效成份的含量及生物学活性受自然条件及加工因素等的影响较大，制约了中医中药的发展。虽然目前已发展了一些技术方法应用于中药有效成份及生物学活性的分析，如薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、含药血清分析法等，但这些方法在分析中药及其组方药的有效成份及生物学活性方面仍存在一定的局限性［1,4］。?
党参(人参)属于补气类中药，也是组方药四君子汤的主要配伍成份。目前的研究表明，党参中的主要化学活性成份有多种，为皂甙类和多糖类物质，有兴奋中枢神经、增强学习和记忆、刺激免疫反应相关受体的作用。因此，党参及四君子汤的药理作用主要是一种针对细胞信号转导网络系统，并借此调控细胞的各种生理功能的综合生物学作用［2-5］。?
本研究试图通过蛋白质组的树状分层聚类分析，获得单味药党参及组方药四君子汤作用于小鼠神经元后蛋白质组表达模式，全面了解党参及相关组方药对细胞的综合药理作用及其变化规律，从而为中药中医的现代化研究提供一条新的途径。?
1 材料与方法?
1.1 中药材:党参、白术、茯苓和炙甘草购自泸州宝光医药有限公司，经生药学鉴定后备用。?
实验动物及试剂:昆明种封闭群乳小鼠由泸州医学院动物科提供。?
NEUROBASALTM, B27 supplement，丙烯酰胺，N,N-甲叉双丙烯酰胺，SDS，DTT，TEMED，碘乙酰胺(IEA)，Bio-lyte，CHAPS，尿素，IPG胶条(pH4-7, 17cm)，Tris均购自BIO-RAD公司；蛋白质分子量标准购自碧云天公司；其余为国产分析纯试剂。?
1.2 实验方法:(1) 标准药物制剂的制备:单味药党参及复方药四君子汤(由党参、白术、茯苓和炙甘草组成，比例为2：1：1：1)分别按常规方法浸提煎制2次，合并煎液并浓缩至党参生药浓度为1.0g/ml，离心去沉淀，蒸气流通灭菌，4℃保存［6］；临用前用RPMI-1640培养液稀释至0.5g/ml。(2)小鼠神经元培养:取乳小鼠的脑组织，D-Hank"s液洗涤2次，加0.25 g/L胰蛋白酶消化8 min，加入Hank"s液终止酶消化，1200 r/min 离心8 min，弃上清，沉淀中加Hank"s液洗涤1次，离心收集沉淀，加入RPMI-1640培养液(含青霉素、链霉素以及10% 胎牛血清)，以1×106接种，置CO2 培养箱 (5 %CO2，37℃) 中培养。24 h 后更换含Neurobasal Medium和B27的RPMI-1640培养液培养7d。(3) 药物作用及蛋白质的提取:小鼠神经元随机分为3组，即空白对照组（Control）、党参组（Dangshen）和四君子汤组（Sijunzi）。各组分别加入等量含药或空白培养液，置CO2 培养箱中(5 %CO2，37℃)孵育20min，液氮终止反应，生理盐水洗涤3次，加细胞裂解液(8 mol/L 尿素，40 g/L CHAPS，2 mmol/L Bio-lyte，2 mmol/L TBP)4℃裂解细胞；4℃，12000 r/min 离心60min，收集上清液，按Bradford法［7］测定蛋白质含量。(4)双向电泳:将300/g蛋白质样品与100 ?l样品水化液(8 mol/L尿素，40 g/L CHAPS, 2 ml/L Bio-lyte, 40mmol/L DTT，微量溴酚蓝)混匀，置水化槽中，放入IPG胶条，室温下水化12 h。将IPG胶条转移至等电聚焦电泳槽，于17℃进行等电聚焦，总伏时数约80000(V/h)。将聚焦后的IPG胶条在平衡液Ⅰ(0.375 mol/L，pH 8.8 Tris-HCl，8 mol/L尿素，20 g/L SDS，200 ml/L甘油， 20 g/L DTT)和平衡液Ⅱ(0.375 mol/L pH 8.8 Tris-HCl，8 mol/L尿素，20 g/L SDS，200 ml/L甘油，25 g/L IEA)中分别平衡15min，再置10% SDS凝胶板上端，加入电极缓冲液( pH 8.3，0.025 mol/L Tris，0.2 mol/L glycine，1 g/L SDS)进行第二向电泳分离。(5) 凝胶染色:将凝胶置固定液（50%甲醇，10%乙酸）中固定1h，双蒸水漂洗30min，加入新鲜配制的银染溶液（0.36% NaOH，30% 氨水，200 g/L AgNO3）振荡15min，双蒸水漂洗，加新鲜配制的显色液（1%柠檬酸，37%甲醛）作用5min后，1%乙酸终止反应。(6)图像采集与数据分析: 利用凝胶成像系统将电泳图谱扫描至计算机，根据IPG胶条的线性pH梯度和标准分子量Marker，确定蛋白质斑点的实验pI和MW，采用ImageMaster 2D Platinum双向电泳图谱分析软件进行表达蛋白质组的差异分析及定量分析，各蛋白质斑点的表达量以相对总灰度值（%Vol）表示。(7)蛋白质组表达模式的聚类分析:将各组蛋白质斑点的SpotID和标准化总密度值（%Vol）组成分析矩阵，采用EPCLUST（https://www.bioinf.ebc.ee/EP/EP/EPCLUST/）分析软件进行基于相关性的平均距离树状分层聚类分析。?
2 结果?
2.1蛋白质组表达模式的树状分层聚类:采用ImageMaster 2D Platinum软件自动检测分析各组双向电泳图谱，在pI 4.0~7.0、MW 26.0~140.0 kDa的范围内，检获并匹配蛋白质斑点共计414个；采用EPCLUST软件对蛋白质斑点的相对总灰度值（%Vol）进行聚类分析，获得的热谱图及树状分层图（见图1），即依据蛋白质斑点表达量的变化规律可将党参及四君子汤作用于小鼠神经元的蛋白质组表达模式分为5大类型（Ⅰ~Ⅴ类群）。从上到下依次为：第Ⅰ种表达模式有43种蛋白质，占总数的10.39%；第Ⅱ种表达模式有50种蛋白质，占总数的12.08%；第Ⅲ种表达模式有12种蛋白质，占总数的2.90%；第Ⅳ种表达模式有139种蛋白质，占总数的33.58%；第Ⅴ种表达模式有170种蛋白质，占总数的41.06%。 ?
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图1 党参及四君子汤作用的蛋白质组表达模式树状分层聚类图和热谱图?
Fig. 1 The Hierarchical Clustering and Hot Maps of Proteomic Expression Profiling?
by Codonopsis pilosula and Four-gentleman Decoction?
2.2 蛋白质组表达模式各类型的变化规律:计算各类型蛋白质组中每一种蛋白质斑点与同类型蛋白质组中其他蛋白质斑点的相对总灰度值(%Vol)之间决定系数平方的均数(r?2?―)，选择 值最大者为该类型表达模式的典型代表(如表1)。计算各类型表达模式典型蛋白质斑点相对表达量变化率(%)并作图，即可显示各类型蛋白质组表达模式的变化规律(见图2)。?
表1 典型蛋白质斑点的特征性表达模式?
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* ID值可随软件系统设定而改变。?
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图2 各类型蛋白质组表达模式的变化规律?
Fig. 3 Characteristics of Proteomic Expression Profiling with Each Class?
如表1和图2所示，党参及四君子汤作用于小鼠神经元的蛋白质组表达模式存在一定的规律性，其变化特征为：第Ⅰ类为全抑制型，即党参刺激组和四君子汤刺激组均为表达抑制，尤以党参刺激组抑制更为明显；第Ⅱ类为党参刺激组单一抑制型；第Ⅲ类为双向调控型，即党参刺激组表达增强而四君子汤刺激组表达抑制；第Ⅳ类为全激活型，即党参刺激组和胰岛素刺激组均为表达激活；第Ⅴ类为四君子汤刺激组单一激活型。总体上来说，全激活型和单一激活型表达模式所占比例较大(74.64%)，全抑制型和单一抑制型表达模式所占比例较小(22.47%)。因此，党参及四君子汤作用于小鼠神经元的主要生物学效应是刺激大多数细胞内蛋白质的表达增强。?
3 讨论?
本研究采用蛋白质组表达模式聚类分析方法，探讨了党参及组方药四君子汤对小鼠神经元蛋白质组表达模式的影响及其变化规律。从我们的研究结果来看，党参及四君子汤对小鼠神经元蛋白质组表达模式表现为五大类型(群)；第Ⅰ~Ⅱ型为抑制性表达模式，第Ⅲ型为双向调控表达模式；而第Ⅳ~Ⅴ型则为兴奋性表达模式。因此，党参及四君子汤对小鼠神经元蛋白质组表达模式具有一定的特征性。同时，不同的药物，或同种药物但有效活性成份不同时，对蛋白质组表达模式的影响也不同。我们已观察到，党参及四君子汤与党参及胰岛素(类补气药)对小鼠神经元蛋白质组表达模式的影响存在明显的差异(另文发表)，因此，蛋白质组表达模式的分析将有可能应用于药物，特别是有效成份复杂的中药药理作用的评价中。?
蛋白质组表达模式聚类分析是一种数据挖掘的重要手段，特别适用于大规模数据的综合分析。通过对大规模数据的归类和统计，从而发掘出各数据间的相互联系及变化规律［8］。中药及其组方药常常含有多种活性成份，对细胞或人体的生物学作用或药理作用较为广泛。因此，单一观测指标常常难以对中药的药理作用做出全面的评价［1-3］。我们的研究结果表明，蛋白质组表达模式的聚类分析能够通过对细胞全部蛋白质表达状态的变化及类群变化规律的整体分析，较为全面地反映含有多种化学活性成份的中药及其组方药对细胞的综合药理作用，从而为中医药的现代化研究提供了一条新的途径。??
参考文献?
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