[摘要]目的：探讨不同浓度普萘洛尔在不同时间段内对血管瘤内皮细胞的抑制作用。方法：收集手术切除的新鲜婴幼儿血管瘤标本，采用组织块法培养内皮细胞，免疫荧光法对培养的细胞进行鉴定；通过绘制生长曲线和流式细胞仪检测普萘洛尔(propranolol) 对血管瘤内皮细胞增殖影响。结果：伴随普诺洛尔浓度增大(0μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，120μg/ml)及作用时间的增加（24h,48h,72h）对血管瘤内皮细胞的抑制作用明显增强；流式细胞仪测定不同浓度普萘洛尔作用不同时段后 血管瘤内皮细胞凋亡明显。结论：普萘洛尔能抑制血管瘤内皮细胞的增殖并促进其凋亡，抑制血管瘤的生长。
[关键词]普萘洛尔；血管瘤内皮细胞；凋亡
[中图分类号]R732.2 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）04-0602-03
Effects of propranolol on proliferation of hemangioma endothelial cells from infantile
YANG Yong-qin,SUN Mo-yi,LI Jian-hu,LIANG Liang,SHEN Zhi-yuan
(Department of Oral and Maxillofacial Surgery,School of Stomatology,The Fourth Militiary Medical University,Xi＇an 710032,Shanxi,China)
Abstract: Objective To investigate the Effects of propranolol on proliferation of hemangioma endothelial cells from infantile. Methods In this study,we treated the vascular endothelial cells of hemangioma in 96-well plates with different dose(0μg/ml to 120μg/ml)of propranolol.the survival and proliferatoin of the vascular endothelial cells of hemangioma were evaluated by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetra-zoloum(MTT) assay and crystal violet assay. The effects of propranolol on the vascular endothelial cells of hemangioma were observed by cell growth curves and flow cytometry. Results With the augmentation of the concentration of propranolol (0μg/ml,20μg/ml, 40μg/ml, 60μg/ml, 80μg/ml, 100μg/ml, 120μg/ml)and the lengthening of action time（24h,48h,72h）,proliferation of hemangioma endothelial cells are inhibiting apparently.AnnexinV-PI assay were aslo performed.propranolol could inhibit the growth of vascular endothelial cells of hemangioma and advancing apoptosis. Conclusion Propranolol is able to inhibit the proliferation of the hemangioma endothelial cells , and to advance apoptosis of vascular endothelial cells,resulting in inhibition of hemangioma.
Key words:Propranolol; hemangioma endothelial cells；apoptosis
针对血管瘤，目前临床常用的药物主要有糖皮质激素、干扰素α、环磷酰胺、长春新碱等，然而，这些药物均有其不同程度的不良反应，因此在临床使用中受到不同程度的限制。自2008年，法国Bordeaux儿童医院Léauté-Labrèze等医生在美国《新英格兰医学杂志》报道了他们应用普萘洛尔（propranolol）治疗婴儿血管瘤的重大发现。报道用β受体阻断剂-普萘洛尔（propranolol）成功治疗小儿血管瘤患者后，因普萘洛尔耐受性良好，相比类固醇有较少的副作用，或将成为药物治疗血管瘤的新选择。本实验采用组织块法培养出血管瘤内皮细胞，并将不同浓度普萘洛尔添加到传代后的血管瘤内皮细胞培养基中进行培养。探讨普萘洛尔是否对血管瘤内皮细胞有抑制作用，进而证明其对血管瘤是否有治疗作用。
1 材料和方法
1.1 标本来源：第四军医大学口腔医院手术切除的血管瘤标本。
1.2 主要试剂和仪器：DMEM/F-12培养基培养基（Hyclone）、胰蛋白酶（Amresco）、青霉素+链霉素、胎牛血清(胎牛血清)，D"hanks（武汉谷歌生物），鼠抗人Ⅷ因子、MTT （北京索莱宝）、DMSO（北京索莱宝）、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（凯基生物），96孔培养板（Corning）、CO2恒温培养箱（SANYO）、FAC-SCalibur型流式细胞仪(Becton Dickinson公司)、计算机数据处理软件(BD公司Cellquest软件)。
1.3 血管瘤内皮细胞分离和培养：①标本， 4℃无菌D～Hank液试管中保存；②用D-Hank液及PBS液冲洗标本至肉眼观察冲洗液颜色清亮，无浑浊及脱落组织；③去除多余的皮肤及脂肪，选择瘤体组织，适当修剪成1～2cm3的组织块， 0.25%胰蛋白酶中37℃振荡消化10～20 min，加入含1O%胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)培养液中止消化；④将消化后的组织微粒，接种于事备好的培养皿内，静置10 min；然后加入约0.5ml完全内皮细胞培养基(成分DMEM/F-12培养基培养基、20% 胎牛血清、1O IU L青霉素、100 mg／I 链霉素)，仅使培养液刚刚湿润组织块，勿使组织块浮起，置于培养箱内孵育；⑤24 h后补充培养基，使培养液缓慢浸润组织块，置培养箱继续培养；5 天后更换培养液；⑥接种后1周去除组织块，倒置相差显微镜下确认内皮细胞岛，用细胞刮去除非内皮细胞，更换培养液后继续培养，每3天更换培养液1次；⑦细胞汇合成片铺满培养皿时按1∶3比例传代培养。
1.4 血管瘤内皮细胞形态学观察、鉴定
1.4.1 形态学观察：倒置相差显微镜下观察血管瘤内皮细胞生长情况和形态学特征，并用数码照相机记录观察的结果（图1）。
1.4.2 免疫荧光法鉴定：将血管瘤内皮细胞进行细胞爬片， PBS冲洗2遍，4%多聚甲醛室温下固定30 min，PBS冲洗，0.3%的过氧化氢室温下封闭10 min，然后用正常血清室温下封闭10 min，分别加入第Ⅷ 因子相关抗原鼠抗人抗体(工作浓度l∶200) 4℃过夜，PBS冲洗后在暗室条件下加入鼠抗兔二抗荧光显色液，荧光显微镜下观察拍照（图2）。
1.5 MTT对血管瘤内皮细胞毒性的测定
1.5.1 MTT检测细胞抑制率：①将对数生长期细胞用胰蛋白酶消化后配制成浓度为1～10×104个/ml的细胞悬液，经过细胞技术按10000细胞/孔接种于96孔板，每孔加200μl；②将平板置37℃、5%CO2湿度培养箱中24h后，于24h、48h、72h分别加入各个细胞样品对应的含有一定浓度药物（0μg/ml,20μg/ml,40μg/ml,60μg/ml,80μg/ml,100μg/ml, 120μg/ml）的培养基，每个样本浓度设平行的三个孔，对照组加不含样本的培养液200μl，再放入培养箱中孵育；③于倒置显微镜下拍照，拍摄200×的细胞状态；④每孔加入用按5mg/ml新鲜配制的MTT溶液50μl，温育4h，使MTT还原为甲瓒，当在倒置显微镜下看到孔板内的细胞周围出现丝状紫色结晶体时倒掉上清液，每孔加DMSO（二甲基亚砜）200μl，用平板摇床摇匀后，使用酶标仪测定光密度值（OD）（检测波长570nm），以溶剂对照处理细胞为对照组，按公式计算普萘洛尔对细胞的抑制率。
1.5.2 改良寇式法计算IC50：
改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大剂量，I:lg(最大剂量/相临剂量)，P:阳性反应率之和，Pm:最大阳性反应率，Pn:最小阳性反应率
1.6 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡：①接种细胞至六孔板，吸除培养液，用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1ml胰酶消化细胞，待细胞变圆，部分细胞悬浮，即加入PBS终止消化；②用移液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮.离心1 500转5min，弃上清；③加入3ml PBS，用漩涡震荡仪是细胞充分悬浮于PBS中，离心1 500转5min，弃上清；④加入300μl的裂解缓冲液（Binding Buffer）悬浮细胞；⑤Annexin V-FITC，Propidium Iodide （PI）使用前瞬时离心集液；⑥加入5μl Annexin V-FITC混匀后，加入5μl Propidium Iodide，混匀；⑦室温、避光、反应5～15min.8.在1 hour内，进行流式细胞仪的检测.用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm；发射波长Em=530 nm。Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测；PI红色荧光通过PI通道（FL2）检测。
1.7 统计结果χ2检验：不同浓度(0μg/ml,20μg/ml, 40μg/ml,60μg/ml,80μg/ml,100μg/ml,120μg/ml)作用后血管内皮细胞作用不同时间（24h,48h,72h）后抑制率。统计学处理：应用spss17.0统计软件包对细胞增殖抑制率进行分析。采用总体方差分法,P