摘要：目的：评价二十碳五烯酸体外对人肝胆管癌细胞株FRH-0201增殖的影响。 方法：在处于指数生长期的FRH-0201细胞株培养剂中添加二十碳五烯酸(EPA)，通过采用MTT法检测EPA体外对FRH-0201细胞的增殖抑制率及IC50，绘制细胞生长曲线以及流式细胞术检测细胞周期来观察EPA对FRH-0201细胞增殖的影响；吖啶橙荧光染色、电镜技术观察FRH-0201细胞凋亡时的形态学特征及超微结构的改变，AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡率。结果：经EPA处理后，FRH-0201细胞增殖受到明显抑制，并且呈明显的量效关系和时效关系。同样条件下正常小鼠成纤维细胞L-929无明显影响。细胞阻滞在G0/G1期。吖啶橙染色细胞内有明显的黄绿色浓染，电镜观察细胞染色质浓缩，EPA 50、70μg/mL作用48h的细胞凋亡率分别为37.3%和62.2%，明显高于正常对照组。结论：EPA体外能通过诱导FRH-0201细胞发生凋亡抑制其增殖。
关键词：二十碳五烯酸(EPA)；人肝胆管癌细胞珠;增值;细胞凋亡率
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0556-03
Influence of EPA on Multiplication of Human Cholangiocarcinoma Cell Strain
ZHANG Qing1, WANG Xiang?qun1, CHEN Li?juan1, WU Dan2
(1.The First People’s Hospital of Yuhang District, Hangzhou 311100, Zhejiang, China;
2.Department of General Surgery,The Second Affiliated Hospital of Medical School of
Zhejiang University,Hangzhou 310006, Zhejiang, China)
Abstract:Objective: To evaluate the influence of EPA on multiplication of Human cholangiocarcinoma cell strain FRH-0201. Method: Add EPA into exponential growth phase FRH-0201 cell strain. Detect the suppression ratio and IC50 of FRH-0201 cells in vitro with EPA through MTT method. Draw a cell growth curve and FCM detect cell cycle to observe the influence of EPA on mutiplication of FRH-0201 cells. AO fluorescent stain and electron microscope were used to observe the apoptosis of FRH-0201 cells on morphology feature and ultrastructure changes.AnnexinV/PI dubble stain were used to detect the apoptosis rate. Result:After adding EPA, the multiplication of FRH-0201 cells were apparently inhibited in the dose-response and time-response relationship . No response in the mouse fibroblast L-929 within the same condition. The cells were blocked in the G0/G1 phases. Yellow green thick strain was found in the AO stain cells.Chromatin concentration was found in the electron microscopy . The 48h apoptosis rate with 50 and 70μg/mL EPA was 37.3% and 62.2%,apparently higher that of normal control group. Conclusion:EPA will induce the apoptosis of FRH-0201 cells in vitro to inhibit their multiplication.省略。癌细胞和正常组织在脂质代谢上有着根本的区别[1]，利用不饱和脂肪酸可达到治疗肿瘤同时不伤害正常组织的目的。含有两个或两个以上双键的不饱和脂肪酸为多不饱和脂肪酸(PUFA)，PUFA在体外能杀死肿瘤细胞。ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFA)是人体必须的营养成分之一。近年来，ω-3多不饱和脂肪酸对肿瘤的抑制作用成为国内外研究的热点。我们在先前的研究中已发现DHA对人胃癌细胞AGS具有显著的增殖抑制作用，其主要途径是下调COX-2的表达，诱导细胞凋亡[2]。ω-3PUFA的另一个成员为二十碳五烯酸（EPA），许多体内和体外实验研究表明其对多种肿瘤具有抑制效应[3]。肝门部胆管癌是一种起病隐匿，根治困难，预后很差的消化系统恶性肿瘤，胆管癌的生物学特性决定了其对常规化疗药物敏感性差，化疗效果不理想。国内吴小鹏等人从肝门部胆管癌原发灶取材，建立了一株能较好地代表胆管癌原发灶细胞所有群体的胆管癌细胞FRH-0201，为研究肝门部胆管癌的发生发展、抗癌药物筛选、基因治疗等提供了良好的实验模型。目前尚未见ω-3PUFA对肝胆管癌影响的报道。本文旨在研究EPA体外对人肝胆管癌FRH-0201细胞的增殖的影响。
1材料与方法
1.1主要试剂与仪器
RPMI 1640、胎牛血清：美国GIBCO公司；噻唑蓝（Thiazolyl blue，MTT）：美国Sigma公司；细胞周期检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒：南京凯基生物技术有限公司；吖啶橙（acridine orange）：AMRESCO。Forma 3111型细胞培养箱，Thermo公司；SW-CJ-2F超净工作台，苏州净化；Sorvall Legend Mach 1.6R离心机，Thermo公司；BIO-RAD 680酶标仪；Axiovert 200荧光倒置显微镜，ZEISS；BECKMAN COULTER Epics Altra流式细胞仪；HITACHI-7650型透射电镜；LEICA EM UC7超薄切片机；EMITECH K850临界点干燥仪；E-1010 Ion Sputter (Au) E3P真空喷镀仪。
1.2药物配制
EPA购自美国Sigma公司（产品号：E0441），以无水乙醇溶解，置-70℃避光保存备用。临用前用RPMI1640培养基稀释配置成不同浓度，并将无水乙醇终浓度控制在0.1%以下。
1.3细胞培养
人肝胆管癌细胞株FRH-0201购自美国模式培养物典藏所（American Type Culture Collection, ATCC）；小鼠成纤维细胞L-929，购于中科院上海细胞生物所。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中传代培养。取对数生长期细胞，经胰酶消化后，调整细胞浓度进行实验。
1.4对FRH-0201细胞的增殖抑制率及IC50
取处于对数生长期的FRH-0201细胞，以RPMI 1640培养液制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，于37℃、5%CO2细胞培养箱内孵育24h，加入100μL不同浓度的EPA稀释液(100、50、25、12.5、6.25、0μg/mL)，每个浓度重复8孔。同时设立正常小鼠成纤维细胞L-929为对照。继续培养48h，各孔加入50μL MTT溶液(2mg/mL)，再继续培养2h。弃去各孔培养液，分别加入150μL 酸性DMSO溶液，振荡使结晶溶解，于室温暗处放置10min，以酶标仪于波长570nm测定OD值，按下列公式计算抑制率(%)。以NDST软件，Bliss法求出IC50。
细胞抑制率(%)＝(1-加药细胞OD值对照细胞OD值)×100%。
1.5对细胞生长曲线的影响
传代培养的FRH-0201细胞以不同浓度的EPA(40、30、22.5、16.875、12.656、0μg/mL)分别处理24、48、72、96h，用台盼蓝染色后计算台盼蓝拒染细胞数，由此计算出活细胞浓度并绘制药物作用细胞96 h的生长曲线图。
1.6对细胞周期的影响
FRH-0201细胞经不同浓度的EPA稀释液(70、50、32、0μg/mL)处理48h后，收集细胞，经预冷的PBS洗两次，调整浓度为1×106个/mL，预冷的70%乙醇固定，4℃避光保存24h，加100μL Rnase A 溶液，37℃水浴加热30min，再加入400μL 碘化丙啶(PI)染色液，混匀，4℃避光放置30min，BECKMAN COULTER Epics Altra型流式细胞仪检测细胞周期，记录激发波长488nm处的红色荧光。
1.7荧光染色形态学观察
对数生长期的FRH-0201细胞经不同浓度的EPA稀释液(0、24、32、60μg/mL)处理24h后，吖啶橙染液(5μg/mL)染色荧光显微镜下观察并拍照。
1.8电镜检查
不同浓度的EPA稀释液(0μg/mL、40μg/mL)处理细胞24h后，收集细胞，2.5%戊二醛溶液于4℃固定过夜，乙醇脱水，行透射电镜观察并拍照。
1.9流式细胞仪测细胞凋亡率
以不同浓度的EPA稀释液(0、32、50、70μg/mL)处理细胞48h后，收集约1~5×105个细胞，PBS洗2次，加入500μL Binding Buffer悬浮细胞；加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5μL PI，混匀，室温避光染色5~15min，流式细胞仪以激发光波长488 nm进行DNA分析，所得数据用流式细胞仪自备软件分析。
2结果
2.1EPA对FRH-0201细胞株的增殖抑制作用及IC50
MTT法测定结果表明，EPA对FRH-0201细胞作用48h后，明显抑制FRH-0201细胞增殖，最高抑制率达89.92%±0.42%，IC50值为(32.20± 1.70μg/mL。见表1。EPA对正常小鼠成纤维细胞L-929无明显抑制作用，不同浓度组间及对照组OD值相比差异无显著性（P＞0.05）。见表2。
表1EPA对FRH-0201细胞增殖的抑制率和IC50
DrugConc. (mg/mL)6.2512.52550100FRH-02019.45±5.1914.95±5.7231.08±7.4172.60±4.8589.92±0.42表2EPA对L-929细胞增殖的影响
Conc. (mg/mL)Control6.2512.52550100L-9290.515±0.0330.509±0.0640.517±0.1150.510±0.1340.479±0.1630.480±0.1492.2对生长曲线的影响
台盼蓝拒染细胞数法测定EPA对FRH-0201细胞生长曲线的影响。结果表明，EPA各浓度在0～96h间对FRH-0201细胞增殖均有抑制作用，并呈时间依赖性。见插页Ⅴ图1。
2.3对细胞周期的影响
流式细胞仪检测分析结果表明，FRH-0201细胞经EPA 32、50、70μg/mL处理48h后，其G0/G1期细胞百分比随着EPA浓度的增加而上升，而S期和G2/M期细胞百分比则显著下降(插页Ⅴ图2)。细胞阻滞在G0/G1期。
2.4荧光染色形态学观察
吖啶橙染色后，在荧光显微镜下观察，对照组FRH-0201细胞核DNA显黄绿色均匀荧光，EPA各处理组细胞核或细胞质内可见致密的黄绿色荧光，甚至可见浓染的黄绿色碎片，呈现典型的细胞凋亡形态学变化。见插页Ⅴ图3。
2.5电镜观察
透射电镜观察FRH-0201细胞的超微结构，发现经EPA 40μg/mL处理24h后，胞浆内形成空泡，细胞核染色质发生边集固缩，在核膜周边聚集形成高电子密度的质块，呈现典型的凋亡细胞形态改变。见插页Ⅴ图4。
2.6流式细胞仪分析细胞凋亡率
AnnexinV/PI双染法是敏感的早期凋亡检测方法，早期凋亡细胞以AnnexinV-FITC染色为主。晚期凋亡或坏死细胞则AnnexinV-FITC/PI双染色。结果显示，EPA 50、70μg/mL作用48h的细胞凋亡率分别为37.3%和62.2%，明显高于正常对照组（1.3%）。EPA 50、70μg/mL作用48h的晚期凋亡细胞和坏死细胞比例分别为7.0%和7.5%。见插页Ⅵ图5和表3。
表3FRH-0201细胞经EPA作用48h后的凋亡率
组别细胞凋亡率（%）坏死细胞率（%）正常对照组1.31.3EPA 32μg/mL6.53.4EPA 50μg/mL37.37.0EPA 70μg/mL62.27.53讨论
药物抗肿瘤作用的最主要机制之一即抑制肿瘤细胞的增殖。已有大量研究表明，DHA和EPA在体外能通过多种途径抑制肿瘤细胞增殖。对乳腺癌MCF-7、MDA-MB-31细胞、胃癌MGC-803、MGC-823细胞、肝癌HepG2细胞、白血病HL-60细胞、人结肠癌、前列腺癌PC-3细胞等多种细胞株均有显著的增殖抑制作用[4-6]。
本研究中我们发现，EPA对FRH-0201细胞作用48h后，明显抑制FRH-0201细胞增殖，最高抑制率达89.92％±0.42％，IC50值为（32.20± 1.70）μg/mL，呈明显的量效关系。EPA处理后FRH-0201细胞96h的生长曲线显示，EPA对FRH-0201细胞的增殖抑制作用与时间呈良好的线性关系。但同样条件下EPA对正常小鼠成纤维细胞L-929无明显抑制作用，不同浓度组间及对照组OD值相比差异无显著性。显然，不能单纯地用细胞毒作用来解释EPA对FRH-0201细胞的增殖抑制作用。这与先前我们对DHA的研究结果一致。并且再次印证了ω-3不饱和脂肪酸可能通过抑制细胞有丝分裂抑制增殖[7]。
细胞增殖是通过细胞周期来实现的，DNA周期检测可用来反应细胞周期各个期的状况，即细胞增殖状况[8]。本研究发现，FRH-0201细胞经EPA 32、50、70μg/mL处理48h后，其G0/G1期细胞百分比随着EPA浓度的增加而上升，而S期和G2/M期细胞百分比则显著下降。细胞阻滞在G0/G1期。由此发现，EPA对FRH-0201细胞的增殖抑制作用可能是通过调节细胞周期来实现的。
有研究表明，影响细胞周期是ω-3多不饱和脂肪酸诱导肿瘤细胞凋亡的主要途径之一[9]。普通光镜检查发现FRH-0201经EPA处理后呈现细胞凋亡的形态，提示EPA体外可能通过诱导细胞凋亡来抑制FRH-0201细胞的增殖。吖啶橙染色后荧光显微镜观察发现EPA处理后FRH-0201细胞显示典型的黄绿色浓染凋亡特征[10]。电镜检查显示EPA处理后FRH-0201细胞超微结构发生了明显的凋亡样变化，如细胞缩小，核浓缩，胞浆内空泡，染色质凝聚。初步证实EPA能诱导FRH-0201细胞凋亡。我们运用Annexin V/PI双染试剂盒通过流式细胞仪检测不同浓度EPA处理后FRH-0201细胞的凋亡率。结果显示，EPA 50、70μg/mL作用48h的细胞凋亡率分别为37.3%和62.2%，明显高于正常对照组（1.3%）。这个结果非常有力地确证了EPA体外能通过诱导FRH-0201细胞发生凋亡抑制其增殖。
参考文献
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