[摘要] 目的 研究兔椎间盘退变过程中软骨终板TNF-α表达及其对蛋白多糖、胶原合成的影响。方法 选用新西兰白兔36只，随机分为实验组和对照组。采用椎间失稳方式诱发椎间盘退变。于术后12w、24w和36w取材进行组织学观察、TNF-α含量检测。并采用来源猪的终板软骨细胞进行传代培养，采用同位素方法，检测外源性TNF-α对培养软骨终板细胞蛋白多糖及胶原合成的影响。结果 随着不稳时间延长，软骨终板出现明显退变，软骨终板变薄、钙化，细胞数目减少。实验组TNF-α含量较对照组明显增高，但24w与36w之间无差异。TNF-α处理组，培养终板软骨细胞的蛋白多糖合成和胶原合成量均较对照组显著性减少。结论 软骨终板退变过程中，早期TNF-α表达显著性增加，而TNF-α具有抑制培养软骨细胞蛋白多糖和胶原合成的作用。独活寄生汤对椎间盘退变炎性因子表达的影响可能是今后研究的方向。
[关键词] 独活寄生汤； 软骨终板； 椎间盘退变； TNF-α
[中图分类号] R68 [文献标识码] B [文章编号] 1005-0515（2012）-02-001-01
Expression of TNF-αin rabbit degenerated endplate cartilage and its effect
Chen Zuyan 1 Jiang Jianning 1 Yang Yong 2 Liu Bin 3 Qu Dongbin 2 HuangJuewei 1 ZhangYuzhi 1 LuZhisun 1
CuiXiaozhong 1 YuYichun 1 QiLeijing 1 WuWencong 1
(1Kaiping TCM Hospital Guangdong Kaiping 529300,2Nanfang Hospital Southern Medical University Guangdong Guangzhou 510515,
3The third affiliated Hospital Sun Yet Shun University Guangdong Guangzhou 510630)
[Abstract] Objective To study the expression of TNF-αin endplate cartilage during the degenerative progress of rabbit spine, and the effect of TNF-α on synthesis of proteoglycan and collagen of cultured endplate cartilage cells.Methods thirty-six New Zealand rabbits were divided randomly into two groups,experimental group and control group.In the experimental group,the disc degeneration was created by intervertebral instability in rabbits.On the interval of 12w,24w,36w,the endplate cartilages were harvested to be examined histologically and the expression of TNF-α.The endplate cartilage cells cultured from adult pigs were used for detection of proteoglycan and collagen synthesis after treatment of exogenous TNF-α.Results With the expanding period of intervertebral instability,the endplate cartilage showed more degenerative changes including thinning and calcification of endplate and scarcity of cartilage cells.The contain of TNF-αin the experimental group was significantly higher than that of control group, but no significant difference was found between the experiment groups in 24w and 36w.After treatment of exogenous TNF-α,the endplate cartilage showed decreased synthesis of proteoglycan and collagen compared with control group.Conclusion during the degenerative progress of endplate cartilage,the expression of TNF-α is significant in the early stage,and TNF-αhas the inhibition effect of proteoglycan and collagen synthesis.It may be further study for the Duhuo Jisheng Tang on expression of inflammatory factors during disc degeneration.
[Key words] Duhuo Jisheng Tang； Endplate cartilage； disc degeneration； TNF-α
独活寄生汤作为一个成分，对脊柱退变性疾患及骨关节病的治疗具有一定疗效，但其作用机制尚不清楚。刘英杰等在动物模型上，证实独活寄生汤可以减低佐剂性关节炎软骨中TNF-α的表达，认为独活寄生汤可能作用机制是通过抑制关节软骨的炎性因子表达而发挥作用[1]。在以往实验中，我们采用椎间动力失稳模型成功诱导兔椎间盘退变[2-3]。在此基础上，本项目研究在兔椎间盘退变过程中，TNF-α在软骨终板的表达以及其对培养软骨细胞合成蛋白多糖、胶原的影响，以进一步探讨独活寄生汤的可能作用机理，为后续研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 动物实验
1.1.1 软骨终板退变模型 选用6-8月龄雄性新西兰白兔36只，随机分为实验组和对照组。实验组组用10%水合氯醛20mg/Kg静脉麻醉后，将动物俯卧固定于手术台上，备皮，碘酒、酒精消毒，铺巾。沿L1-L7棘突做后正中切口，长约10cm，贴棘突两侧切断椎旁肌附丽，将附着于棘突、椎板及小关节的肌肉全部分离开，暴露棘突、椎板和关节突。然后依次切除L1-L7的棘上、棘间韧带及两侧关节突关节后外1/2，依次缝合各层组织。对照组动物仅切开皮肤后不作肌肉分离及韧带切除。术后动物在笼中自由活动。实验组与对照组分为12w、24w和36w组，每组动物6只。于各观察时间点，处死动物，分别进行组织学观察及软骨终板TNF-α测定。
1.1.2 组织学观察 处死动物后，取出腰椎间盘，置于4%多聚甲醛溶液固定48h。15%EDTA溶液脱钙，EDTA溶液量是固定组织的20倍左右，置于37℃温箱内，每周换液一次。行梯度酒精脱水，浸蜡包埋。切取椎间盘矢状面切片，片厚5μm，进行HE、甲苯胺蓝染色，观察软骨终板形态的变化。在日本OlympusBXDX光学显微镜观察。
1.1.3 软骨终板TNF-α测定 处死动物后，立即在无菌操作下取出L3～4椎间盘。将软骨终板置于24孔培养板内，在37℃，5% CO2条件下，用含10%胎牛血清的DMEM2ml培养，72h后取上清液，集中待测。待全部标本收集完全后，按放免检测试剂盒说明书操作，测定TNF-α含量，TNF-α结果以ng/ml表示。TNF-α检测试剂盒由北京解放军总医院放免研究所提供。
1.2 TNF-α对培养终板软骨细胞蛋白合成的影响 5只长枫杂交猪，雄性，体重18-20kg，静脉注射2%戊巴比妥钠1.5ml/kg麻醉、无菌操作下软骨终板取材培养，将生长状态良好的第二代软骨终板细胞传代[4]。软骨终板细胞接种于24孔培养板内，待细胞进入亚融合状态后，每孔加入含5%的胎牛血清的DMEM培养基培养1.5ml，分组为空白对照组，TNF-α组(终浓度为50ng/ml，英国PeproTech公司产品)，每组复设12孔。培养24小时后，有6孔每孔加入5μCi/mlNa235SO4培养12小时，闪烁计数仪计数，结果以cpm表示，以35S掺入法检测蛋白多糖合成。另6孔每孔加入1μCi/ml3H-脯氨酸培养24小时。闪烁计数仪计数，结果以cpm表示，以3H-脯氨酸掺入法检测胶原合成。
1.3 统计学分析 数据以x±S，采用配对t检验，以SPSS10.0软件包进行统计学处理。P0.05)。
2.3 TNF-α对培养终板软骨细胞蛋白合成的影响 软骨终板细胞需要摄入35S和3H-脯氨酸用于糖胺多糖和胶原的合成，因此，通过测定35S和3H-脯氨酸摄入量的多少，即可反应基质蛋白多糖及胶原的合成量。结果显示，TNF-α处理组产生的蛋白多糖和胶原合成量，与对照组之间的差别均有显著性意义(P