摘要：目的：考察5种中药注射剂对多柔比星(DOX)作用下H9c2心肌细胞损伤的保护作用。方法：应用H9c2心肌细胞筛查体系，通过检测细胞存活率、过氧化物岐化酶(SOD)活性和氧化代谢产物(MDA)含量，考察参麦注射剂、丹参注射剂、冠心宁注射剂、香丹注射剂和黄芪注射剂等5种中药注射剂对暴露于1.7×10-4至2.2×10-9 M浓度DOX下H9c2心肌细胞的存活率的影响。结果：黄芪注射剂和香丹注射剂能提高DOX作用下心肌细胞的存活率，有效地缓解DOX所引起的心肌细胞MDA浓度增高，提高SOD酶活性且不影响DOX的体外抗肿瘤活性。结论：黄芪注射剂和香丹注射剂能降低DOX对心肌细胞的毒性作用，可能是通过增加抗氧化物酶活力，减少氧化产物生成，从而减轻氧化应激损伤这些途径实现的。
关键词：多柔比星；H9c2心肌细胞；丹参注射剂；参麦注射剂；冠心宁注射剂；香丹注射剂；黄芪注射剂
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0483-03
Protective Effect of Five Injections on Doxorubicin-Induced
Cytotoxicity in Cardiac Myoblasts H9c2
XIN Yan?fei,ZHOU Guo?liang,HAN Bin,YOU Zhen?qiang,XUAN Yao?xian
(Center of Safety Evaluation,Zhejiang Academy of Medical Sciences,Hangzhou 310013,Zhejiang,China)
Abstract:Objective:To test whether five injections can transfer its antioxidant function into the protection of the doxorubicin (DOX)-induced cardiotoxicity in cardiac myoblasts H9c2. Method:H9c2 cells were exposed to DOX and/or five injection. The peak concentration of five injection of protective effect on DOX-induce was evaluated through examination, level of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) activity.The effects of five injections on the cytotoxicity of DOX to H9c2 cells and A549 lung carcinoma cells were studied. Results:Huangqi injection and Xiangdan injection had protective effect on H9c2 cells against DOX and significantly increased SOD activity and decreased the MDA level in H9c2 experimental system damaged by DOX exposure while not attenuate the antitumor activity of DOX on A549 carcinoma cells. Conclusion:Our evidence indicates that Huangqi injection and Xiangdan injection elicited a typical protective effect on DOX-induced cytotoxicity in cardiac myoblasts H9c2 via suppressing oxidative stress.
Key words:doxorubicin; cardiac myoblasts H9c2; Danshen injection; Shenmai injection; Guanxinning injection; Xiangdan injection; Huangqi injection
收稿日期：2011-11-28
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30701064）；国家“十二五”科技重大专项资助项目（2011ZX09301-003）；浙江省科技计划项目（2010F10026，2009C13024）；浙江省中医药管理局资助项目（2007CB187）
作者简介：辛艳飞（1976-），男，山西人，副研究员，博士，研究方向：药物毒理学。
通讯作者：宣尧仙（1954-），女，浙江人，研究员，研究方向：药物毒理学。多柔比星（Doxorubicin，DOX）是一种广谱高效的蒽环类抗肿瘤药物，但其所引起心肌损伤和充血性心力衰竭是DOX临床应用的主要不良反应之一[1-2]。DOX致心脏毒性的机制尚不完全清楚，但一般认为其心脏毒性的主要原因是：DOX在代谢过程中生成活性氧，进而氧化损伤心肌细胞膜和线粒体膜[1-2]。因此大量的研究试图从抗氧化的机制来寻找能对抗DOX心脏毒性的药物。中药复方、中药活性组分等天然抗氧化剂（如四逆汤，丹酚酸等）均被证实可以有效缓解DOX引起的动物心肌损伤[3-4]。我们选取了参麦注射剂（Shenmai injection）、丹参注射剂（Salvia injection）、冠心宁注射剂（Guanxinning injection）、香丹注射剂（Xiangdan injection，XD）和黄芪注射剂（Astragalus injection，HQ）等5种具有抗氧化活性的心血管疾病用注射剂，利用H9c2心肌细胞筛查体系，筛选防御DOX心肌损伤的中药注射剂，同时考察其对于DOX抗肿瘤活性的影响。
1材料和方法
1.1药品注射用盐酸多柔比星（10mg/瓶），浙江海正制药有限公司生产，实验时用0.9%NaCl注射液配制为1mg/mL的初始溶液；参麦注射剂、丹参注射剂、冠心宁注射剂、香丹注射剂和黄芪注射剂，正大青春宝药业有限公司生产。
1.2试剂胎牛血清(美国Gibco公司)，胰蛋白酶(美国DIFCO公司)，DMEM高糖培养基 (美国Gibco公司)，丙二醛(MDA)测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。
1.3H9c2细胞的培养H9c2大鼠心肌细胞株购自上海生命科学研究院细胞库。H9c2细胞培养于含10％胎牛血清（HyClone）的高糖DMEM培养液，置37 ℃、5% CO2培养箱培养。传代比例1：2，每隔1天传代1次。当细胞到达指数生长期时，用培养基稀释细胞到50000个/mL。
1.45种中药注射剂对DOX所致H9C2损伤的保护细胞实验时，用DMEM培养液将多糖母液稀释30倍。1mg/mL的DOX溶液用DMEM培养基稀释为0.2 mg/mL，以此浓度为首浓度3倍逐级稀释。96孔板每孔加入100μL H9c2心肌细胞（约5000个/孔）和50μL中药注射剂溶液（原液用培养基稀释5000倍），混匀后培养24h。加入50μL DOX溶液至终浓度至1.7×10-4～2.2×10-9M，孵育48 h。用结晶紫法检测细胞存活率。按试剂盒操作规程测定MDA、SOD。阴性对照中用培养基代替DOX溶液，空白对照中用培养基代替中药注射剂溶液和DOX溶液，其余操作采用相同处理。
1.55种中药注射剂对DOX抗肿瘤活性的影响A549肺癌细胞株购自上海生命科学研究院细胞库。A549细胞培养于含10％小牛血清的DMEM培养液，置37 ℃、5% CO2培养箱培养。96孔板每孔加入100μL A549心肌细胞（约5000个/孔）和50μL中药注射剂溶液，混匀后培养24h。加入50μL DOX溶液至终浓度至1.02,0.35,0.12×10-7M，孵育48 h。用结晶紫法检测细胞存活率。
1.6结晶紫法检测细胞存活率细胞培养结束后，去除培养液，每孔中加入200μL 11％的戊二醛固定20min。弃去戊二醛，细胞用去离子水洗涤两次。细胞培养板置37℃烘箱中彻底干燥后，每空加入0.1％的结晶紫液100μL，振摇染色30min。弃去染色液，用去离子水洗涤两次。细胞培养板置37℃烘箱中彻底干燥后，加入10％的乙酸提取细胞吸收的结晶紫。在595 nm测定光吸收度，按如下公式计算存活率：存活率=（A给药孔-A空白孔）/（A对照孔-A空白孔）×100 %[5]。
1.7统计方法各组实验数据以(±s）表示。两组间比较采用t检验，P ［4］Jiang B, Zhang L, Li M, et al. Salvianolic acids prevent acute doxorubicin cardiotoxicity in mice through suppression of oxidative stress [J]. Food Chem Toxicol, 2008, 46(5):1510-1515.
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