【摘要】目的：探讨羟基红花黄色素A对鼠骨折端主要细胞（成骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞）Toll样受体4（TLR4）表达的影响。方法 SD大鼠股骨骨折对接后14天骨折端的骨痂，进行成骨细胞、内皮细胞的原代培养。实验分4组，即对照组、骨康泰灵组、羟基红花黄色素A高、低量组。应用RT-PCR及Western-blot方法检测TLR4 mRNA表达及蛋白含量。结果 羟基红花黄色素A高剂量组成骨细胞、内皮细胞）、巨噬细胞TLR4 mRNA和蛋白含量低于对照组（P＜0.05）。结论：羟基红花黄色素A能降低成骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞 TLR4mRNA和蛋白表达。
【关键词】羟基红花黄色素A；TLR4；骨折端骨痂
EFFECT OFSafflomin A on the expression of TLR4 in callus osteoblasts, endothelial cells,macrophages./ Lu Chenyong / Chines medicine hospital Dian bai County Guang dong province
【Abstract】ObjectiveTo study the effects OFSafflomin A on the expression of TLR4 in callus osteoblasts,endothelial cells(EC),macrophages(MC). MethodsNormal osteoblasts were obtained for primary cultured of callus .The cells were divided into control group, Safflomin A high dose group and Safflomin A low dose group. Total mRNA and protein content of each group were analyzed by RT-PCR and Western blot, respectively. ResultsThe expression of TLR4 mRNA and protein content of osteoblasts,endothelial cells,macrophages Safflomin A high does group were significantly lower than in control group（P＜0.05）.ConclusionSafflomin A could down-regulaate the the expression of TLR4 mRNA callus osteoblasts, endothelial cells, macrophages.
【Key words】Safflomin A; TLR4; callus
研究表明在细胞内TLR4 mRNA 表达过强可影响细胞的分化[1]。骨折后骨折端骨痂中成骨细胞的分化程度决定着新生骨的形成。羟基红花黄色素A（hydroxysafflor yellow A）是具有单查尔酮苷类结构的化合物，是红花药理功效的最有效水溶性部位，有活血抗凝作用[2]。笔者羟基红花黄色素A对骨折端骨痂的成骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞表达进行了研究，报告如下。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1全自动四孔水浴式PCR仪器 型号:SF31-FS-91（辽宁沈阳），垂直型电泳槽和湿式电转膜槽，电转膜仪（美国Bio-Rad 公司），DF-C 型电泳仪。
1.1.2试药 羟基红花黄色素A（四川曼思特生物科技有限公司）；RT-PCR 相关试剂（美国Gibac bird 公司）；免疫印迹相关试剂（北京东方德教育科技有限公司）。
1.1.3动物SD大鼠，雌雄不限，体重250-300g.
1.2方法
1.2.1细胞培养 取SD大鼠股骨骨折对接后14天骨折端的骨痂，进行成骨细胞、内皮细胞的原代培养。于37℃、5%CO2培养箱培养细胞，细胞密度为1×109个?L-L。用DMAM完全培养基（10%FBS，10万IU?L-L青霉素、10万ug?L-L链霉素）培养巨噬细胞（RAW264.7）；2.2模型及分组实验分4组，即对照组（正常细胞培养，加入等数量的培养基，不加入任何药物）、骨康泰灵组（加入等数量的培养基3h，再加入骨康泰灵注射液1mg）、羟基红花黄色素A高剂量组（5mg）、低剂量组（1mg）。
1.2.2应用RT-PCR及Western-blot方法检测TLR4 mRNA表达及蛋白含量应用Ultraspec TM-II RNA分离系统(Biotecx Laboratories，INC)提取总RNA，逆转录成cDNA，进行PCR反应。RT-PCR按照Takara公司试剂盒说明书进行操作。主要细胞TLR4及GAPDH(内参对照)引物序列及片段长度为：TLR4(356 bp)： AAACTTGCCTTCAAAAC：CTGGC ACCTGAACTCATCAATGGTCA;GAPDH(695bp):GGGAAGCT
CATCGGCATGGCTTCTTGATGTCATCATACTTGGCAG。
1.2.3免疫印迹法弃取培养基，用冰PBS洗2次，加入细胞裂解液，在冰上静置10-20分，转移PBS管中，加入1/3体积的4×sample buffer， 煮沸10 min，超声粉粹，室温下12000 r?min-1离心10 min ，取上清液。SDS-PAGE电泳分离蛋白，一抗37℃ 2h ,TBS 冲洗3×15min,碱性磷酸酶标记2抗37℃ 1h ,TBS冲洗3×15min,NBT方法显色10min。扫描分析。
1.2.4 统计学处理 数据应用SPSS13.0统计软件处理，X±s表示。采用单因素方差分析，组间比较用LDS检验分析。显著性水平P＜0.05。
2结果
2.1羟基红花黄色素A高剂量组成骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞TLR4 mRNA和蛋白含量低于对照组（P＜0.05）。见表1和表2。
表1 羟基红花黄色素A高剂量组成骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞TLR4 mRNA表达
表2羟基红花黄色素A高剂量组成骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞TLR4蛋白表达
2讨论
骨折后，因骨折本身及邻近软组织的血管断裂出血，在骨折部位形成 了血肿，血肿于伤后6-8小时即开始凝结成含有网状纤维素的血凝块。骨折断端因血循环 中断，逐渐发生坏死。随着红细胞的破坏，纤维蛋白的渗出，毛细血管的增全，成纤维细胞、吞噬细胞、异物巨细胞的侵入，血肿逐渐机化，肉芽组织再演变成纤维结缔组织，使骨折断端初步连接在一起，称为纤维性骨痂，约在骨折后2-3周内完成。研究表明，Toll样受体4（TLR4）表达影响骨折端主要细胞：成骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞的分化。1997年Janeway等首次在人体分离出果蝇Toll的同系物,将其命名为TLR4。随后在人类已发现有11种TLR。TLRs与PAMPs相互作用启动相应免疫应答，在机体的天然免疫和获得性免疫中发挥重要作用。近年来,表达在抗原提呈细胞(antigen presentation cells,APC)的TLRs在肿瘤免疫中的作用越来越引起人们的兴趣,包括通过应用免疫佐剂的作用来增强TLRs识别肿瘤细胞产生的“危险信号”,促进针对肿瘤的免疫应答。在细胞内TLR4 mRNA 和TLR4蛋白表达过强可影响细胞的分化。骨折后骨折端骨痂中成骨细胞中TLR4 mRNA 和TLR4蛋白表达可影响影响细胞分化。因此，如何在骨折端骨痂中的骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞TLR4 mRn和TLR4蛋白表达。
羟基红花黄色素A具有单查尔酮苷类结构的化合物，是红花药理功效的最有效水溶性部位，可抑制血小板激活因子诱发的血小板聚集与释放，可竞争性地抑制血小板激活因子与血小板受体的结合，是红花黄色素的活血化瘀有效成分[3、4]。它是一种好的医药原料，也可用于制作保健和化装品，还是很好的食品染料,抗血小板和抗心肌缺血作用。羟基红花黄色素A具有抗凝血酶诱导的血小板聚集活性[5]，抗炎活性，细胞保护活性，抗肿瘤活性，也有消肿止痛、舒脉壮骨之功效，改善骨折局部的微循环，消肿止痛的作用，同时促进骨折局部血供，激活细胞分裂，促进骨折愈合作用。
本研究结果显示，羟基红花黄色素A高剂量组成骨细胞、内皮细胞）、巨噬细胞TLR4 mRNA和蛋白含量低于对照组（P＜0.05）。羟基红花黄色素A能降低成骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞 TLR4mRNA和蛋白表达。从而促进骨折端骨痂中的成骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞的分化。
参考文献
［1］Holmlund U, Cebers G, Dahlfors AR, et al.Expression and reg-ulation of the pattern recognition receptors Toll-like receptor-2 in the human placenta. Immunology, 2002, 107(1):145-151.
［2］王兴文,周晓红,郭锐,李莉,彭吉霞. 红花甙对小鼠脑缺血再灌注后记忆行为的影响[J山西医科大学学报，,2005,(02) .
［3］金鸣,高子淳,李金荣.大孔树脂诸色谱法制备红花黄色素和羟基红花黄色素[J].中草药,2004,35(1):25-28.
［4］朱海波,王振华,田京伟，等.羟基红花黄色素a对实验性脑缺血的保护作用［j］.药学学报，2005，40(12)：1144-1146.
［5］盛雨辰，夏玉叶.羟基红花黄色素a对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用［j］.中国医药工业杂志， 2006，37(2)：104-106.