摘要：目的：观察中药止咳平喘合剂对哮喘大鼠肺内嗜酸粒细胞（Eosinophil, EOS）及嗜酸粒细胞趋化因子（Eotaxin）表达水平的影响，探讨中药止咳平喘合剂治疗哮喘的可能作用机制。方法：用改良的卵白蛋白多点注射致敏与雾化吸入激发法建立大鼠哮喘模型。将60只雄性SD大鼠随机分为6组，每组均10只，分别为正常对照组、哮喘模型组、强的松组、止咳平喘合剂小剂量组、中剂量组和大剂量组。实验第15天起灌胃给药，根据等效剂量换算比率计算，正常对照组、哮喘模型组分别给予生理盐水10mL/kg，强的松组给予强的松混悬液10mg/kg，止咳平喘合剂小剂量组7.5g/kg，中剂量组15g/kg，大剂量组30g/kg，给药连续5天，每天1次。末次雾化激发后24h处死大鼠留取标本。镜下观察各组哮喘大鼠肺组织病理形态的变化及支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞、EOS计数的变化；免疫组化染色法检测肺组织Eotaxin蛋白的表达水平。结果：哮喘模型组大鼠BALF中EOS数量明显增高，与其它各组相比，均存在显著性差异(P0.05）。结论：止咳平喘合剂可明显减轻哮喘大鼠气道炎症，其机制可能与其减低哮喘大鼠肺组织Eotaxin蛋白的表达相关。
关键词：止咳平喘合剂；哮喘；嗜酸粒细胞；Eotaxin
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0573-03
收稿日期：2011-10-19
基金项目：浙江省中医药科技计划一般项目（2008CA094）
作者简介：王媛（1975-），女，吉林吉林人，助理研究员，硕士，研究方向：呼吸感染与免疫的研究。Study of Effects of Zhike Pingchuan Mixture on EOS and Eotaxin
Expression in Asthmatic rats
WANG Yuan1,ZHOU Zhong?hui1,YU Ya?li2,BAO Yi?jun2,LI E1
(1.First Affiliated Hosptal of Zhejiang University of TCM,Hangzhou 310006,Zhejiang,China;
2.Ningbo Hospital of TCM,Ningbo 315010,Zhejiang,China)
Abstract:Objectives: To observe the effects of Zhikepingchuan Mixture on Eosinophil (EOS) and Eotaxin expression of allergic-induced asthmatic rat and investigate the mechanism if Zhikepingchuan Mixture treating asthma. Methods: Asthma rats models were induced by modified intraperitioneal sensitization and challenged with nebulized ovalbumin.Sixty male SD rats were randomly divided into six experimental groups(10 in each): normal control group, asthma model group, positive control group (prednisone group), low-dose group of Zhikepingchuan Mixture, middle- dose group of Zhikepingchuan Mixture, high-dose group of Zhikepingchuan Mixture. From the15th day,The normal control group and the asthma model group received normal saline in 10mL/kg;the positive control group received prednisone in 10mg/kg； the low dose group received 7.5g/kg of Zhikepingchuan mixture(containing crude drug 2.0g/mL), and middle dose group received 15g/kg, and high dose group 30g/kg. All drugs were given for 5 days, once a day. After excitation in the last 24h,rats in each group were all put to death. We intivigated the change of eosinophils count, the total count of leukocyte in BALF and the change of lung tissue of each group by microscope. The expression of eotaxin in the lung tissues was detected by immunohistochemical staining. Results: The count of EOS and the total count of leukocyte in BALF of the asthma model group were significantly increased compared with those of normal group and each treatment group(P0.05). Conclusions: Zhikepingchuan Mixture also can decrease the expression of eotaxin in the lung tissue. So Zhikepingchuan Mixture has the role of restraining airway inflammatory in asthmatic rats.
Key words:Zhike Pingchuan Mixture; asthma;eosinophil; eotaxin
气道炎症是哮喘气道高反应性AHR的基础，EOS是哮喘的支气管黏膜特征性炎症中关键的效应细胞[1-2]。EOS的趋化、活化、脱颗粒作用受多种细胞因子调节，其中Eotaxin是目前发现作用最强、最专一的因子，在哮喘的发病过程中，它可与EOS表面的CCR3受体特异性结合，从而募集、趋化和激活EOS[3-5]。本实验通过建立大鼠哮喘动物模型，观察止咳平喘合剂对哮喘大鼠Eotaxin表达的影响，探讨其能否通过抑制Eotaxin表达而发挥疗效，从而进一步深化探讨名老中医经验方的作用机制。
1材料与方法
1.1实验动物分组健康成年雄性SD大鼠60只，清洁级，体重（200±20）g，由浙江中医药大学动物实验中心提供。随机分为6组：空白对照组、模型组、阳性对照组、止咳平喘合剂大剂量组、止咳平喘合剂中剂量组、止咳平喘合剂小剂量组，每组动物均为10只。实验动物饲养于浙江中医药大学动物实验中心三级实验动物房内。
1.2实验药物及试剂OVA（V级）由美国Sigma公司提供；止咳平喘合剂由浙江中医药大学中药制剂室制成流浸膏，含生药2.0g/mL；强的松片由浙江仙居制药股份有限公司生产；羊抗Eotaxin蛋白多克隆抗体（编号：BA1469）由武汉博士德生物技术司提供；免疫组化试剂盒（批号：10N1775A）由丹麦DAKO公司提供
1.3造模与给药方法实验第1天，第8天将除空白对照组以外每只大鼠多点注射新鲜配制的0.1%OVA+10%AL(OH)3+生理盐水混悬液共1mL以致敏，空白对照组予以同等剂量生理盐水；造模后第15天开始灌胃，中药治疗组分别给止咳平喘合剂小剂量组7.5g/kg，中剂量组15g/kg，大剂量组30g/kg，阳性对照组给强的松混悬液10mg/kg，空白对照组、模型组给生理盐水10mL/kg，每天1次，连续5天；第17、18、19天给药1h后将大鼠分别置于30cm×30cm×40cm玻璃容器中，模型组、阳性对照组及各中药治疗组均采用1%OVA生理盐水溶液超声雾化，自然吸入20min左右以诱发哮喘，空白对照组用等量生理盐水雾化吸入；以呼吸急促深快，烦燥呛咳，四肢搔抓，点头运动及粪便增多等症状的出现为激发成功；并于最后一次激发后24h将各组大鼠全部处死。
1.4指标检测结扎右侧主支气管，行左侧支气管肺泡灌洗。将收集的BALF摇匀，取200μL加入200μL白细胞稀释液，用血球计数板在普通光镜下计数白细胞，将其余BALF以1200r/min的速度离心10min，沉淀物涂片，HE染色后在400倍放大倍数下，连续数500个细胞并计数嗜酸性粒细胞。取右下肺置于10%中性甲醛溶液固定24h后制作成石蜡组织块和切片，分别行Giemsa染色及免疫组织化学染色，光学显微镜观察哮喘大鼠支气管及肺组织内的炎症变化及Eotaxin表达情况。Eotaxin免疫组化半定量分析方法：在使用Image－ProPlus 6.0图像分析软件对免疫组化Eotaxin的表达采用定量测量积分光密度（IOD）的方法，即：每张切片随机采集3个细支气管，经过该系统自动分析获得该3个视野的细支气管上皮细胞Eotaxin表达强弱的3个阳性细胞积分光密度值，经平均后代表该标本的染色强度，然后进行整理及统计分析。
1.5统计方法采用SPSS 15.0统计软件包进行处理。多组间比较用单因素方差分析，予以方差齐性检验，方差齐性两两比较采用LSD联合SNK法检验，相关性分析采用Spearman检验，所得数据以均数±标准差(±s)表示，以P0.05），见表1。
表1各组大鼠BALF白细胞总数和
EOS计数（n=10，±s）
组别白细胞总数
（×105/L）EOS计数
（×105/L）EOS百分比
(%)正常对照组16.51±0.201.06±0.016.41±0.09哮喘模型组49.65±1.70＃＃10.76±0.13＃＃21.60±1.13＃＃阳性对照组18.48±0.43**＃＃1.25±0.01**＃＃6.73±0.22**＃＃止咳平喘合剂小剂量组22.83±1.16**＃＃1.82±0.02**＃＃8.09±0.38**＃＃止咳平喘合剂中剂量组22.54±0.39**＃＃1.81±0.02**＃＃8.00±0.11**＃＃止咳平喘合剂大剂量组22.25±0.53**＃＃1.81±0.02**＃＃8.13±0.23**＃＃注：与正常对照组相比，＃P0.05），哮喘模型组肺组织Eotaxin蛋白表达显著高于正常对照组，有显著性差异（P0.05）；止咳平喘合剂各剂量组之间肺组织Eotaxin蛋白表达均无显著性差异（P均>0.05），见表2，插页Ⅷ图7～12。
表2各组肺组织Eotaxin 蛋白阳性
表达IOD值（n=10，±s）组别Eotaxin (IOD)正常对照组0.0211±0.0061哮喘模型组0.0345±0.0079＃＃阳性对照组0.0235±0.0044**止咳平喘合剂小剂量组0.0222±0.0031**止咳平喘合剂中剂量组0.0263±0.0055**止咳平喘合剂大剂量组0.0252±0.0026**注: 与正常对照组相比，＃P