【中国分类号】 R730.3【文献标识码】 B【文章编号】 1044-5511（2012）02-0010-01?? 肥大细胞（mast cell,MC）是多数脊椎动物疏松结缔组织中常见的细胞，广泛分布于机体各个器官，尤其是皮肤真皮、消化管管壁、呼吸道管壁等全身各处的结缔组织中。来源于骨髓的肥大细胞，以前体的形式离开骨髓，随血流迁移至结缔组织，并在那里增殖分化为形态上特异的成熟肥大细胞。MC最为主要的生物学特征之一就是它的异质性。上世纪初, 有些人观察到大鼠不同部位的MC形态存在一定的差异性［1］。起源于骨髓干细胞, 但分化成熟过程及其生理功能却不尽相同。前体MC离开造血器官, 进入胸腺后就可诱导分化成黏膜肥大细胞, 而进入腹腔内就分化成结缔组织肥大细胞。Fujita等［2］报道, 改变各亚型的相应生长环境, 它们可以发生表型的互换。因此，分选并鉴定出各发育时期肥大细胞，对肥大细胞的发育和功能系统性研究具有重要的意义。本文对肥大细胞发育各时期的分离鉴定方法进行综述。?
（一） 小鼠胚胎血始祖肥大细胞鉴定?
胚胎血Thy-llowc-Kitlhigh 细胞在形态发生学上被证实为早期的始祖肥大细胞 ［3］。它含有胞浆颗粒，表达RNAS编码的肥大细胞相关蛋白酶，缺乏高亲和力的免疫球蛋白IgE受体的表达。Thy-llowc-Kitlhigh细胞在体外能产生功能活性，当转移到腹膜内能再生腹膜肥大细胞。这种肥大细胞前体在形态和功能上都有别于造血干细胞。为了评价造血潜能，在体外培养了胚胎血Thy-l-c-Kit+ 和胚胎血Thy-llowc-Kitlhigh细胞［4］。胚胎血Thy-l-c-Kit+ 细胞在仅有IL-3时就能产生集落群，在SCF作用下能产生放大效应。而胚胎血Thy-llowc-Kithigh细胞在IL-3或SCF单独作用下并不产生集落群，而需二者同时存在。大量实验证明胚胎血Thy-l-c-Kit+细胞比胚胎血Thy-llowc-Kithigh 细胞更能产生多细胞系发育。分离胚胎血Thy-llowc-Kithigh细胞，通过电镜观察［5-9］，刚分离的胚胎血Thy-llowc-Kithigh细胞具有未成熟肥大细胞的典型特征，细胞核，胞浆，高尔基体，内质网等超微结构不同于嗜碱性粒细胞［6 、8、9］。在 IL-3 和SCF 作用下培养, 胚胎血Thy-llowc-Kithigh细胞成为少核浆比例，较多甲苯胺蓝染色阳性的颗粒的未成熟肥大细胞。培养了13天后胚胎血Thy-llowc-Kithigh 细胞就具有更丰富的胞浆和更多的胞质颗粒。肥大细胞的常见特征是表面特异性蛋白酶［10］，故利用半定量RT-PCR，特异蛋白酶(MCCPA,MMCP-2, and MMCP-4) RNA的表达来分析两种胚胎血肥大细胞。胚胎血Thy-llowc-Kithigh 细胞表达这三种蛋白酶，而胚胎血Thy-l-c-Kit+细胞要在上述细胞因子培养后才被表达。成熟的肥大细胞高表达IgE 受体(FcεRI) ,分析胚胎血Thy-l-c-Kit+和Thy-llowc-Kithigh 细胞编码FcεRIα 链RNA的表达， FcεRIα RNA 在体外两种胚胎血细胞均不表达，而在培养后均表达。在胚胎血Thy-llowc-Kithigh细胞后代的表达量是10-100倍，FcεRIα RNA的表达等同于其结合细胞表面IgE的能力。为了评价体内发育潜能，转移胚胎血Thy-llowc-Kithigh细胞到c-Kit、肥大细胞缺陷的W/WV 小鼠［11、12］。 腹膜内转移5 x 10-3细胞, W/WV 小鼠腹膜腔CTMT重建到野生型小鼠水平，且胞浆颗粒染色为典型的CTMC。?
（二） 小鼠骨髓未分化肥大细胞鉴定?
以前所使用免疫学方法鉴定定向始祖肥大细胞，但并不是使用肥大细胞特异性的抗体，故也可以识别其他细胞，得到的是混合有多项潜能分化的细胞［13-15］。人类造血干细胞亚群, CD34+, c-kit+,和 CD13+, 经流式技术从骨髓中分选出来.这种方法获得的细胞群经细胞培养最终产生的不仅是肥大细胞，还有单核细胞。而通过两种单克隆抗体mAb-AA4和mAb-BGD6连续免疫磁性分离成年小鼠骨髓未分化肥大细胞［16］(AA4-/BGD6+)不包含这些杂细胞。mAb-AA4］识别小鼠肥大细胞表面特有的神经苷脂GD1b的两种衍生物，同时 mAb-BGD6］结合到与FcεRI 不相关位点的RBL-2H3肥大细胞表面。在骨髓肥大细胞成熟的各个阶段 mAb-AA4和 mAb-BGD6 均结合到颗粒肥大细胞。但mAb-BGD6还结合并不被mAb-AA4识别的未成熟肥大细胞。就是这两种单克隆抗体结合肥大细胞形式的差异被用来分离成年小鼠骨髓未分化的肥大细胞(AA4-/BGD6+)。AA4-/BGD6+细胞占骨髓细胞的0.02%、形态特征是细胞核大，胞浆少，细胞器少，无胞质颗粒。刚分离的AA4-/BGD6+ 肥大细胞含有FcεRI α和β 两个亚单位的mRNA。但这种受体并没有在此时期表达在肥大细胞表面，而是在白细胞介素-3（IL-3）和干细胞生长因子（SCF)培养下，分化为表达CD13、c-kit、肥大细胞特异神经节苷脂和FcεRI，具有异染性颗粒的成熟肥大细胞，并能结合免疫球蛋白E(IgE)。聚合酶链反应（PCR）显示骨髓未分化细胞含有肥大细胞特异性蛋白酶和羧肽酶α和β两个亚单位。这些无疑证明了AA4-/BGD6+是肥大细胞的始祖细胞。脾脏是c-Kit、肥大细胞缺陷］的W/W" 小鼠［11、12］成熟肥大细胞出现的第一个部位［17、18］，AA4-/BGD6+ 肥大细胞能在受致死性辐射小鼠脾脏内重建，进一步证明了这些细胞代表了肥大细胞祖。?
（三）组织肥大细胞分离鉴定?
肥大细胞在组织中是其分化成熟的最后阶段，表达一整套特异蛋白酶［10］，发挥各种功能活动。酶消化联合密度梯度离心法已被用来分离人类肺脏、皮肤肥大细胞。肥大细胞的活性经台盼兰染色和血球计数板计数，纯度经细胞离心涂片和甲苯胺蓝染色证实，此方法获得的肥大细胞活性和纯度（约10-30%）均下降。温和酶消化联合FcεRI阳性选择技术大大改善了此状况，成功地从乳腺组织和人类前额皮肤以及肺脏中分离出肥大细胞［19、20］。获得的肥大细胞数量和纯度足以用来研究肥大细胞受体诱导的介质释放，受体依赖的趋向性反应及增殖等活动。但通过定量PCR和微阵列分析遗传特征需要更纯的（>99%）肥大细胞，而流式细胞分选术(FACS)和免疫磁珠分选很好的解决了这一难题。FACS利用肥大细胞表面标志FcεRI或KIT ，抗体anti-FcεRI-APC (或其同型物对照;小鼠 IgG-APC)或 抗体anti-CD117-PE (或同型物对照;小鼠 IgG1-PE)经标准分选程序分选出FcεRI+/CD117+细胞 ;免疫磁珠分选利用抗体识别FcεRI.分选富集组织中肥大细胞［29］。?
综上所述，MC是一种具有高度异质性的细胞群, 其生物学作用也多种多样。MC的异质性与其免疫功能又有怎样的联系, 以及MC异质性的机制、原因等问题尚不清楚。因此，对于肥大细胞各时期分离鉴定，将有助于鉴定肥大细胞祖的候选基因，进一步分析其功能;更加明确肥大细胞和其他血细胞（包括嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞）的关系，更加了解肥大细胞发育分化，迁徙成熟的轨迹，为研究肥大细胞在病理生理情况下的功能打下基础。??
参考文献?
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