摘要：目的：利用正交试验设计研究桑叶总生物碱的最佳提取工艺。方法：以煎煮时间和加水量为考察因素，以总生物碱含量为评价指标，采用正交试验优选最佳水煎煮提取工艺条件。结果：优选的最佳提取工艺为用12倍量水煎煮1h。结论：优选得到的工艺稳定、可行，提取得到桑叶总生物碱含量高。
关键词：桑叶；总生物碱；提取工艺；正交试验
中图分类号：R284.1文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0608-02
Optimization of Extraction Technology of Total Alkaloids from Mulberry
Leaves by Orthogonal Design
DENG Wei?jie, SUN Zhi?ping, LUO Xin?gen, WU Xin?rong
(Department of Pharmacy, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010,Guangdong，China)
Abstract:Objective: To study the best extraction technology of total alkaloids from mulberry leaves by orthogonal design. Method：The extraction technology of total alkaloids from mulberry leaves was optimized by orthogonal experiment with the extraction time and the amount of solvent as factors and with the content of total alkaloids as index. Result：The optimum extraction condition was that the materials were extracted for 1 hour with 12 times amout of water. Conclusion：The technology after optimization had a good stability, the yield of total alkaloids was high, and the method was easy to be operated.省略。桑叶为桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥叶片，具有疏风散热、平肝明目的功效[1]。桑叶含有多种化学成份，如黄酮类化合物、生物碱类化合物、多糖、香豆素、氨基酸、有机酸、维生素、甾体化合物和三萜类化合物[2]。研究表明，桑叶中的多羟基生物碱类成份具有显著的降血糖作用[3-4]。多羟基生物碱及其苷类化合物主要集中在桑叶亲水性较强部位[5]，因此提取桑叶总生物碱拟采用传统的水煎煮工艺。水提取总生物碱工艺有利于工业化生产，此外水提液经过乙醇沉淀能够分离出桑叶中的多糖类物质，桑叶经水提取后的残渣可以进一步采用乙醇提取得到黄酮类有效成份。本试验以桑叶总生物碱为指标，经正交试验设计，优化水煎煮提取桑叶总生物碱的工艺。
1试药、材料与仪器
硅钨酸（分析纯，上海化学试剂公司），盐酸（分析纯，广州化学试剂厂），水（蒸馏水）。桑叶购于广东大翔药业有限公司，产地为广东，经鉴定为桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥叶片。BP210S型电子天平（德国Sartorius公司）。
2方法与结果
2.1桑叶总生物碱的含量测定利用硅钨酸沉淀重量法[6]测定桑叶总生物碱含量。将样品液加盐酸调至pH2左右，逐滴加入10%硅钨酸溶液至沉淀完全，静止至溶液澄清，用定量滤纸（干燥至恒重）滤过，沉淀用1%盐酸和蒸馏水各冲洗3次，并在80℃干燥至恒重，精密称重。桑叶总生物碱以桑叶中特征性生物碱1-脱氧野属霉素（1-deoxynojirimycin,DNJ，分子式为C6H13NO4，分子量为163）计，计算公式为：桑叶总生物碱（mg）＝沉淀重量（mg）×0.1856（理论化学换算因数=4R/ SiO3?12WO3?4R?2H2O=0.1856）。
2.2正交试验设计及结果分析选择水煎煮时间和加水量为2个考察因素，每个因素设3个水平，采用正交试验方法对提取工艺进行优选。选用L9（34）表安排试验，以桑叶总生物碱含量为考察指标，因素水平见表１。称取桑叶10 g，按正交试验设计的条件提取两次，合并煎液，滤过，分别得到9份样品液。样品液按“2.1桑叶总生物碱的含量测定”项进行总生物碱含量测定，正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。
由表2直观分析结果可知，因素对测定结果极差R的影响顺序为因素B（加水量）>因素A（煎煮时间），说明提取过程中加水量比煎煮时间对得到桑叶总生物碱量影响大，且最佳提取工艺为A1B1，即用12倍量水煎煮1h，得到桑叶总生物碱量最大。由表3方差分析结果可知，因素B（加水量）对测定结果有显著性差异（P0.05），最佳提取工艺为B1，即用12倍量水煎煮，得到桑叶总生物碱量最大。综合直观分析和方差分析结果，确定最佳提取工艺为A1B1，即用12倍量水煎煮1h。
2.3最佳提取工艺的验证称取桑叶10g 3份，按正交试验设计优化得出的工艺条件进行提取试验，分别测定桑叶总生物碱含量。结果桑叶总生物碱含量分别为49.5、48.1、51.3mg，与正交试验最佳工艺组数据吻合，表明该最佳工艺提取桑叶总生物碱含量高，工艺稳定，选择结果可信。
表1水提取工艺因素水平表
水平因素煎煮时间（A）/（h）加水量（B）/ （倍）空白（C）空白（D）111221.510-328表2水提取工艺正交试验结果
试验号因素ABCD桑叶总生物
碱（mg）1111150.92122237.83133334.44212345.25223140.36231236.77313240.18321335.59332134.6K141.03345.40041.03341.933K240.73337.86739.20038.200K336.73335.23338.26738.367R4.30010.1672.7663.733表3水提取工艺方差分析结果
方差来源离差平方和自由度F值显著性煎煮时间（A）34.58021.793P>0.05加水量（B）167.04728.661P 3讨论
3.1水煎煮提取工艺生物碱的提取一般采用水或酸水提取法、醇类溶剂提取法和亲脂性有机溶剂提取法[7]。桑叶总生物碱主要为多羟基生物碱及其苷类化合物，具有较强的水溶性[5]，适宜采用传统水煎煮提取法。如果需要进一步分离纯化总生物碱，得到的水提液经过简单有效的处理即可完成，例如将水提液浓缩，加入乙醇沉淀除去桑叶多糖类物质，药液回收乙醇后采用生物碱沉淀试剂分离生物碱或采用离子交换树脂分离生物碱。
3.2桑叶生物碱的含量测定目前桑叶生物碱的含量测定方法主要有：重量法[8]，可见分光光度法[9]，高效液相色谱法（HPLC）[10-13]，气相色谱法（GC）[14]和液相色谱－质谱联用法（LC-MS）[15]。由于桑叶多羟基生物碱化学结构缺乏生色基团，在紫外和可见光范围内没有吸收，因此无法直接采用一般光谱分析方法，必须将生物碱衍生化[10, 11]再进行分析或者使用一些通用型检测器如蒸发光散射检测器（ELSD）[12]、示差折光检测器（RID）[13]进行分析。这些光谱或质谱分析方法具有灵敏度高、结果准确可靠等优点，但上述一些检测器如荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、质谱检测器价格昂贵，故在应用普及方面会受到较大限制。本文采用经典的沉淀重量法[6, 8]测定桑叶总生物碱含量具有操作简单、快捷，不需要复杂仪器，不需要使用昂贵的对照品（如DNJ）等优点。本方法的原理是采用生物碱沉淀试剂硅钨酸与桑叶总生物碱产生沉淀，称定此沉淀重量，换算出生物碱含量。桑叶生物碱为一元碱，与硅钨酸沉淀形式应为SiO3?12WO3?4R?2H2O，因此理论化学换算因数为0.1856（4R/ SiO3?12WO3?4R?2H2O）。鉴于本方法采用生物碱沉淀试剂有可能对非生物碱成分如多肽、蛋白质产生沉淀影响含量测定结果[6]，将样品液加入乙醇沉淀，得到的不溶性成分（含多糖、多肽、蛋白质等）用水溶解后与生物碱沉淀试剂硅钨酸反应，结果未见沉淀产生，表明桑叶中多肽、蛋白质的存在不影响生物碱的含量测定。
3.3正交试验设计正交试验设计优化桑叶总生物碱提取工艺中，以总生物碱含量为评价指标，对煎煮时间和加水量两个因素进行了考察。考察因素选用3水平，水平范围符合一般生产要求。试验结果表明加水量是影响总生物碱含量的显著性因素，可能因为药材原料质地轻体积大，需要更多提取溶剂才能充分煎煮获得高提取效率。本试验没有对提取次数进行考察有以下原因：(1)工业化生产考虑到成本效益因素一般提取2~3次，按生产经验更普遍地提取2次；(2)提取次数为非独立性因素，与煎煮时间和加水量两个因素存在联系，可能不符合正交试验因素设计原则[16]。
4结论
正交试验设计优选得到的工艺稳定、可行，提取得到桑叶总生物碱含量高。
参考文献
［1］国家药典委员会. 中华人民共和国药典：1部[S]. 北京: 化学工业出版社, 2010: 279-280.
[2]李家实. 中药鉴定学[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1996: 292.
[3]Asono N, Tomioka E, Kizu H, et al. N-Containing Sugars from Morus Alba and Their Glycosidas Inhitibory Activities[J]. Carbohydr Res, 1994, 259(2): 243-255.
[4]Kimunar M. Antihyperglycemic Effect of N-containing Sugars Derived from Mulberry Leaves is streptozocin-in-Duced Diebetic Mice [J]. Waken Iyakugaku Zasshi, 1995, 12(3): 214.
[5]杨燕.桑叶化学成分和生物活性研究[D].北京:中国医学科学院药物研究所, 2010: 20-22.
[6]魏璐雪.中药制剂分析[M].上海:上海科学技术出版社, 1997: 134-135.
[7]肖崇厚.中药化学[M].上海:上海科学技术出版社, 1997: 93-94.
[8]邓海波.桑叶降血糖有效成分及黄酮类化合物的研究[D].广西师范大学, 2005: 14-15.
[9]李凡,裘雅渔,钱文春，等.桑叶中总生物碱和1-脱氧野尻霉素的含量考察[J].中国药学杂志, 2008, 43(3): 176-179.
[10]Kim J W, Kim S U, Lee H S. Determination of 1-deoxynojirimycin in Morus alba L. leaves by derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate followed by reversed-phase high-performance liquid chromatography[J]. J chromatography A, 2003, 1002: 93.
[11]刘韦?,赵骏,曾森，等.桑叶总生物碱中1-脱氧野尻霉素的测定及方法学考察[J].天津中医药, 2010, 27(2): 166.
[12]T Kimura, K Nakagawa, Y Saitoc, et al. Simple and rapid determination of 1-deoxynojirimycin in mulberry leaves[J]. BioFactors, 2004, 22: 341-345.
[13]欧阳华学,黎源倩,肖全伟. HPLC法测定桑叶中1-脱氧野尻霉素[J].中草药, 2007, 38(5): 774-776.
[14]Aderbal F Magalhaes, Celira C Santos. Detection of Polyhydroxyalkaloids in Lonchocarpus Extracts by GC-MS of Acetylated derivaties[J]. Phyt.Anal, 2002,13: 215-221.
[15]Nitra Nuengchamnong, Kornkanok Ingkanian, Wiroje Kaewruang, et al. Quantitative determination of 1-deoxynojirimycin in mulberry leaves using liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. J Phar Biom,2007, 44: 853-858.
[16]沈群.中药研究中的正交设计问题[J].数理医药学杂志, 2011, 24(1): 19-20.