[摘要]目的：观察阿司匹林对体外培养的正常人表皮黑素细胞系PIG1细胞的活力、黑素生成及酪氨酸酶活性的影响。方法：用不同浓度的阿司匹林处理PIG1细胞72h，CCK-8比色法测定阿司匹林对PIG1细胞活力的影响；光学显微镜观察细胞形态学变化；氢氧化钠裂解法测定黑素的含量；体外多巴氧化反应法测定酪氨酸酶活性的变化。结果：阿司匹林浓度小于或者等于500μmol/L时无明显细胞毒性；浓度大于或者等于125μmol/L时以剂量依赖方式抑制黑素生成，差异有统计学意义（P0.05）。结论：阿司匹林抑制PIG1细胞的黑素生成，可能应用于色素增多性皮肤病。
[关键词]阿司匹林；黑素细胞；黑素生成；酪氨酸酶
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）04-0593-03
Effects of aspirin on melanogenesis of human epidermal melanocyte cell line PIG1 cells in vitro
TANG Ling-zhen,JIAN Zhe,LIU Bang-min,LI Kai,LI Qiang,LI Chun-ying,GAO Tian-wen
(Institute of Dermatology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi"an 710032, Shaanxi,China)
Abstrat: Objective To investigate the effects of aspirin on cell viability, tyrosinase activity and melanogenesis of human epidermal melanocyte cell line PIG1 cells in vitro. Methods After treating PIG1 cell with aspirin in different concentrations for 72h, we employed CCK-8 assay, oxidative DOPA reaction and NaOH method to measure the cell viability, tyrosinase activity and melanogenesis of PIG1 cells respectively. The morphologic changes of PIG1 cells were observed via light microscope. Results Aspirin had no significant effect on the cell viability of PIG1 cells when the concentrations were lower than 500μmol/L. The melanogenesis of PIG1 cells was remarkably decreased in a concentration-dependent manner by aspirin at the concentrations higher than 125μmol/L (P0.05). Conclusion Aspirin can inhibit the melanogenesis of PIG1 cells, thus it may be developed as a clinical treatment of hyperpigmented skin diseases.
Key words: aspirin; melanocyte; melanogenesis; tyrosinase
人皮肤颜色的深浅主要由表皮中黑素细胞生成的黑素量决定，抑制黑素生成一直是皮肤美白及治疗色素增多性疾病的主要策略。酪氨酸经过一系列氧化反应生成黑素的过程中，需要活性氧的参与[1]，因此，抗氧化剂通常能减少活性氧来抑制黑素的生成[2]。阿司匹林是临床常用的非甾体类抗炎药（NSAIDs），具有解热、镇痛、抗炎等作用。近年来有研究证实阿司匹林具有清除自由基及抗氧化作用[3-4]。有研究发现阿司匹林能降低小鼠B16黑素瘤细胞的酪氨酸酶表达[5]，但阿司匹林对正常人黑素细胞黑素生成及酪氨酸酶活性的影响还未有研究报道。本研究探讨了阿司匹林对体外培养的正常人表皮黑素细胞系PIG1细胞的黑素生成及酪氨酸酶活性的影响，为其应用于色素增多性皮肤病的预防和治疗提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 永生化正常人表皮黑素细胞系PIG1细胞：本实验室保存。由美国Loyola 大学Caroline Le Poole博士赠送。为正常新生儿包皮组织运用逆转录病毒载体转染16型人乳头瘤病毒E6和E7开放读码框得来，与正常黑素细胞生物学特性相似[6]。
1.1.2 主要试剂和仪器：254培养基及人黑素细胞生长添加剂（美国Cascade Biologics/Invitrogen公司），胎牛血清（美国GIBCO公司），阿司匹林（美国Sigma公司），CCK-8（江苏碧云天生物技术研究所），0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（北京索莱宝科技有限公司），NaOH（天津石博迪化工有限公司），左旋多巴（L-DOPA）（美国Amresco公司），TritonX-100（江苏碧云天生物技术研究所），倒置显微镜（日本Nikon公司），酶联免疫分析仪（美国Bio-Rad公司）。
1.2 方法
1.2.1 试剂配制：使用前，人黑素细胞生长添加剂以1:100体积比加入到254培养基中。阿司匹林先用无水乙醇溶解配制成0.5M溶液，再用无血清254培养基配制成10mM浓度的阿司匹林原溶液，保存于4℃冰箱内。
1.2.2 细胞培养：PIG1细胞置于含5%胎牛血清，100U/ml青霉素及100mg/ml链霉素的254培养基中，37℃含5%CO2孵箱内培养。
1.2.3 阿司匹林对PIG1细胞活力影响的测定：采用CCK-8法，取对数生长期细胞，常规消化离心后，调节细胞浓度至2×105/ml，以100μl/孔接种于96孔板，37℃ CO2孵箱培养24h，细胞完全贴壁后吸去原培养基，分别加入100μl无血清254培养基配制的终浓度为62.5μM、125μM、250μM、500μM、1000μM、2000μM的阿司匹林溶液，对照组只加无血清254培养基，每组设3个复孔，并设立空白组（单纯培养基）。37℃ CO2孵箱培养72h后，先用倒置显微镜观察PIG1形态学变化，接着分别向空白组、对照组、阿司匹林处理组每孔加入10μl CCK-8溶液，37℃孵箱内继续孵育90min，酶联免疫分析仪450nm处测吸光度值（A）。阿司匹林处理组相对细胞活力=（A阿司匹林组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%。
1.2.4 阿司匹林对PIG1细胞黑素生成影响的测定[2]：采用NaOH裂解法，取对数生长期细胞，常规消化离心后，调节细胞浓度至5×105/ml，接种及分组同上。阿司匹林处理72h后，吸去上清，用1×PBS洗2次，每孔加入100μl浓度为1M的NaOH溶液，37℃水浴1h，酶联免疫分析仪测定450nm波长的吸光度值（A）。阿司匹林处理组相对黑素含量=（A阿司匹林组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%。
1.2.5 阿司匹林对PIG1细胞酪氨酸酶活性影响的测定：采用体外DOPA氧化反应法,细胞接种方法和分组同黑素含量测定。阿司匹林处理72h后，吸去上清，用1×PBS洗2次，每孔加入90μl浓度为1%的TritonX-100溶液，迅速置于-80℃冰箱内冻存30min，室温下融化使细胞完全裂解。每孔加入100μl浓度为0.1%的L-DOPA（1×PBS配制）溶液，37℃孵育2h，酶联免疫分析仪测定490nm波长的吸光度值（A）。阿司匹林处理组相对酪氨酸酶活性=（A阿司匹林组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%。
1.3 统计学分析：数据以x±s表示，利用SPSS12.0进行单因素方差分析。
2 结果
2.1 阿司匹林对PIG1细胞形态及细胞活力的影响：阿司匹林浓度在62.5～500μM时，PIG1细胞形态与对照组相比，无明显差异。阿司匹林浓度大于1000μM时，细胞树突变短，胞体肥大。细胞活力检测结果为阿司匹林在浓度小于或等于500μM时，细胞活力与对照组相比无统计学差异（P>0.05）。阿司匹林浓度大于或者等于1000μM时，细胞活力以剂量依赖方式降低，与对照组相比，差异具有统计学意义（P0.05）（表2）。
3 讨论
3.1 一直以来，色素增多性疾病如炎症性色素沉着、黄褐斑等都是困扰皮肤科医师的难题。如何在不杀伤黑素细胞的情况下降低黑素合成一直是研究者不断探索的治疗方法。近年来，从植物中提取的具有抗氧化性质的活性成分，如姜黄素[2]、茶黄素[7]、槲黄素[8]、莱菔硫烷[9]等，被证实具有抑制黑素生成的作用。阿司匹林最初来源于柳树，同样发现其具有清除自由基及抗氧化作用[3-4]，因此我们研究了阿司匹林对黑素细胞黑素生成及酪氨酸酶活性的影响。
3.2 本实验中，通过对正常人表皮黑素细胞系PIG1细胞的培养，我们观察到浓度在62.5～500μM之间的阿司匹林对黑素细胞无明显毒性，降低了黑素生成量，但是对酪氨酸酶活性无显著影响。之前Sato K等[5]发现2mM阿司匹林作用5天后，小鼠B16黑素瘤细胞的黑素生成量显著降低，酪氨酸酶蛋白量显著降低，但是体外酪氨酸酶活性无显著变化，与本实验结果基本一致，有些差异可能由于细胞系不同或体外实验误差导致。研究显示大多数药物是通过抑制酪氨酸酶活性来抑制黑素生成[2,8- 9]，但是酪氨酸羟基化形成多巴与多巴氧化形成多巴醌最终生成黑素的一系列反应过程中，涉及多种信号通路，如腺苷酸环化酶/cAMP-依赖蛋白激酶通路、MAP激酶通路、PI激酶/p70SG激酶通路、PKC依赖通路[10]，除了主要的调控因素酪氨酸酶，相关的调控或影响因素还有Pmel基因家族、内皮素、过氧化物酶、多巴醌及转录因子MITF[10-11]，因此阿司匹林可能通过其他途径抑制黑素生成，如可通过抑制COX或NF-κB等影响某个信号通路，导致黑素生成或转运过程中某个步骤改变，或者通过清除自由基改变黑素生成反应中的氧化还原反应，导致不同类型黑素颗粒或者黑素前物质比例改变，进而影响了黑素的生成量。因此，明确阿司匹林对黑素生成的具体影响机制，还需要进行深入的研究来证实。
3.3 阿司匹林临床应用广泛，具有价格实惠、安全性强以及较易推广的特点。临床上有经验显示非甾体类抗炎药治疗炎症后色素沉着有良好疗效，也有研究显示局部应用前列腺素E2、F2α及类似物增加毛发生长和黑素生成[5]。因此，阿司匹林应用于色素增多性疾病的治疗具有良好的前景。同时，阿司匹林对黑素生成的研究将为其治疗色素增多性疾病提供实验依据，为其进一步推广奠定基础。
[参考文献]
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[收稿日期]2011-12-26 [修回日期]2012-02-16
编辑/张惠娟