【摘要】 方法学影响 应对策略 ELISA检测乙型肝炎免疫标志物，因其简便、灵敏、特异性高，成为基层医院对乙肝诊断的主要手段。排除外因操作过程、药物及干扰物、反应温度、离子强等影响因素后。临床还有不可解释的少见模式或矛盾结果时，我们应该重新认识实验本身的方法学设计上的缺陷。为我们的检查过程提出如何应对这些缺陷的策略。?
【关键词】 ELISA；乙肝；方法学；影响因素；应对策略?
【中国分类号】 R512.6【文献标识码】 A【文章编号】 1044-5511（2012）02-0445-01??
ELISA自1971年问世以来，由于其简便、灵敏、特异性高的、酶标记物有效期长、以及是一种快速、低成本的检测方法，广泛应用于医学和生物学科各个领域。依据测定抗原抗体的不同而有不同方法，在测定蛋白大分子时候，采用最多的方法是双抗夹心法；对于只有单个表位的小分子时，则采用竞争法。?
众所周知，抗原抗体反应的影响因素不外乎是内在因素和外界因素，外界环境因素包括微量孔的质量、吸附特性、包被物的纯度、包被质量、孵育温度等因素。本文主要从方法学角度，重点阐述引起临床少见模式以及假性结果的原因以及应对策略。?
1、夹心法 ?
测定HBsAb,采用双抗原夹心法，它测定的抗体是所有类型Ig，包括变性的IgG，不受血液标本中RF因子的影响。因此，双抗原夹心法的灵敏度和特异性要高于间接法。因机体产生的抗体的量是有限的，不会产生hook效应导致假阴性。在测定HBSAg、HBeAg时采用双抗体夹心法。当前北京万泰和英科新创试剂对于测定HBSAg则是采用优化流程的双位点一步法测定，这样就有效的增加了待检抗原与包被抗体之间的反应时间。当血液中RF因子，与多种动物的变性的IgG的Fc段结合而容易产生干扰现象，排除这类干扰，可以先用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶处理去除Fc段，能有效地改善检测特异性 ［1］ 。当血液中的抗原浓度很高时，抗原抗体比例失调，产生hook效应导致假阴性结果。排除hook效应影响，可采用稀释标本重新测定。对于是否为hook效应，也可用多点稀释测定法，如果稀释样本反应信号比未稀释样本高，那就是HOOK效应。?
2、竞争法 ?
测定HBeAb与HBcAb等这类小分子半抗原或抗体时，将待测血清和酶标抗原或抗体同时加入反应孔，竞争结合抗体或抗原。其实，临床一般不用竞争法来测定抗体，只有当抗原中的杂质难以去除或者抗原的结合特异性不稳定时方采用竞争法测定抗体。因为，乙型肝炎e抗原和核心抗原的结构相近，e抗原较核心抗原仅少29个氨基酸，e抗原很容易转变为核心抗原［2］。我科使用万泰生物和英科新创两种试剂，它们对于HBeAb测定试剂工艺流程不一样，万泰采用包被e抗原，英科新创则采用包被e抗体，配以酶标记抗体（HBeAb-HRP）和中和抗原（HBeAg）,竞争结合血液标本中的HBeAb。大概英科新创采用这种方式测定HBeAb，可能主要是考由于HBeAg的不稳定性，防止包被HBeAg向HBcAg转变导致测定误差。同时由于竞争法所用抗体均为动物源性，与机体感染病毒所产生的抗体有所差异，因而临床出现了难以解释的测定结果出现，这是其方法设计本身的缺陷导致的［3］。在竞争法测定抗体过程中与一步法比较没有勾镰效应，避免了假阴性，但方法学的原因导致了灵敏度大大降低，不如夹心法和间接法敏感。?
3、分析与讨论?
从目前的现状来看，ELISA法对两对半检测，多数检测抗原的标记酶效果并不非常理想，容易出现干扰。天然抗原虽有完整表位，由于纯化难，特异性不高，为了减少非特异性抗原的影响而减低抗原的浓度，又让其灵敏度降低；合成多肽则一般为线性多肽片段，未被糖基化，又容易出现抗体检测的假阴性结果；基因重组多肽抗原相对于天然抗原纯度高，特异性高，但它缺乏天然抗原的完整表位，因此可能导致某些抗体的漏检而出现假阴性。同时还可能含有表达载体的蛋白质而导致假阳性结果。在对乙肝的检验中，每一个环节均可影响结果的准确性的。我们能掌控的是要尽可能减少外在因素的影响，根据检测过程中所用的不同方法采取相应的策略。除了选择口碑好，质量优的检测试剂，还应严格遵照说明书使用，比如：试剂恢复室温，是防止载体孔包被物潮解而影响与后续抗原抗体反应。检测中应该严格控制加入待检血清和酶标抗原抗体的时间差，加入样本和酶标试剂的时间差越大，对结果的影响就越明显。洗涤中专用洗涤剂中含tween20，可以有效地减少非特异性吸附和增强抗原抗体结合。还要注意药物及其代谢产物与蛋白质结合、抑制了酶的活性以及干扰某些实验方法的反应等。还应特别注意检测方法的局限性。通常酶标抗原（体）是通过化学交联制备的，一个理想的化学交联是应该得到明确的分子组成、酶及抗体抗原不失活性，标记结合物稳定，现在的化学交联方法还不能完全满足这些要求；抗体的动物源性以及HOOK效应对结果的影响。关键要注意将五项指标结合对应分析。对可疑结果采用不同厂家试剂做平行试验。可以对某些少见型或特殊型予以合理解释，也对解决因结果误差带来的医疗纠纷大有帮助的，同时对临床诊治都具有积极意义。??
参考文献?
［1］ 杨廷彬 免疫学及免疫学检验 人民卫生出版社 1998.131?
［2］ 吴键明 免疫学检验――理论与临床 人民卫生出版社2003.176?
［3］ 吴键明 免疫学检验――理论与临床 人民卫生出版社2003.176