【摘要】目的 针对35名甲型H1N1流感疑似病例进行实验室检测，并根据检测结果对这起甲型H1N1流感疫情进行分析；对real-time RT-PCR方法、鸡胚分离方法的灵敏度进行统计学检验。方法 应用real-time RT-PCR方法、RT-PCR方法、鸡胚分离方法等实验室检测方法对35例甲型H1N1流感疑似病例的标本进行检测；配对设计资料的卡方检验。结果 35例甲型H1N1流感疑似病例中，甲型H1N1流感确诊病例共27例，阳性率为77.14%；对real-time RT-PCR方法、甲型H1N1流感病毒的鸡胚分离方法灵敏度进行统计学检验，差异有统计学意义，可以认为real-time RT-PCR方法灵敏度高于鸡胚分离法灵敏度。结论 此次甲型H1N1流感疫情属于暴发流行，是由于学生开学返校，集体生活引起聚集性群体性发病且无保护性抗体而引起，二代病例发病较多，反映此次甲型H1N1流感传染性较强；根据实验室检测数据可以认为real-time RT-PCR方法的灵敏度高于鸡胚分离法的灵敏度。
【关键词】甲型H1N1流感病毒 暴发 输入性病例 二代病例
中图分类号：R181.8；511.7 文献标识码：A 文章编号：1005-0515（2012）3-330-03
流感病毒分为：甲型（A）、乙型（B）和丙型（C），甲型症状较严重，容易造成大流行；乙型症状较不严重，可造成大流行；丙型症状轻微，较少造成大流行。本次流感为一种新型呼吸道传染病，其病原为新甲型H1N1流感病毒，病毒基因中包含有猪流感，禽流感，人流感三种流感病毒的基因片段。甲型H1N1流感病毒属于正粘病毒科，甲型流感病毒属。典型病毒颗粒成球状，直径为80-120nm，有囊膜，囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是红细胞血凝素（HA），神经氨酸酶（NA）和基质蛋白M2，病毒颗粒内为核衣壳，呈螺旋状对称，直径为10nm，为单股负链RNA病毒，基因组约为13.6kb，由大小不等的8个独立片段组成。病毒对乙醇，碘伏，碘酊等敏感，对热敏感，56℃ 30分钟可灭活。甲型H1N1流感潜伏期一般为1-7天，多为1-4天，通常表现为流感样症状，包括：发热，咳嗽，咽痛，咯痰，流涕，鼻塞，头痛，全身酸痛，乏力，部分病例出现呕吐和腹泻，可伴有眼部充血和扁桃体肿大，可发生肺炎等并发症，少数病例病情进展迅速，出现呼吸衰竭，多脏器功能不全或衰竭，患者原有的基础疾病亦可被诱发加重，呈现相应的临床表现，病情严重者可导致死亡。甲型H1N1流感患者为主要传染源，无症状感染者也具有传染性。甲型H1N1流感主要通过飞沫经呼吸道传播，也可通过口腔，鼻腔，眼睛等处粘膜直接或间接接触传播，接触患者的呼吸道分泌物，体液和被病毒污染的物品亦可能引起感染[1]。由于甲型H1N1流感病毒属于一种新型呼吸道传染病毒，人体不具有保护性抗体，因此人群普遍易感。本病传播迅速，常呈地方性流行或大流行。
1 对象与方法
1.1 研究对象
从2009年9月15日至10月15日某大学某学院发生的112名疑似甲型H1N1流感病例中随机抽取的35例疑似病例作为研究对象。
2 研究方法
2.1 抽样方法―分层抽样
分层抽样是指先将总体按某种特征分为若干次级总体(层)，然后再从每一层内进行单纯随机抽样，组成一个样本。该院分A、B、C、D四个系，从每个系中根据单纯随机抽样的方法抽取共35例疑似病例进行采样，获取标本并进行实验室检测。
2.2 实验室检测方法
按照国家卫生部出台的《甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案（试行）》[2]，应用real-time RT-PCR方法、RT-PCR方法、鸡胚分离方法等实验室检测方法对35例疑似病例的标本进行检测。
2.2.1 标本的采集
采集35例疑似病例的咽拭子标本，置于无菌采样夜2~3ml中，立即用冰块或冰排保存或置于4℃（冰箱），并马上送至实验室进行甲型H1N1流感病毒的病原学检测，避免反复冻融。将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。如不能立即试验应保存在-70℃或-70℃以下，不应保存在-20℃。
2.2.2 核酸检测的材料及仪器
2.3 材料
RNA 提取试剂盒：QIAGen RNeasy Mini Kit
逆转录试剂盒：QIAGEN One step RT-PCR Kit
real-time RT-PCR试剂盒：Super ScriptIMⅢ Platirum One step Quantitative
RT-PCR System
RT-PCR试剂盒：QIAGEN One step RT-PCR Kit
2.4 仪器。
冷冻高速离心机、漩涡振荡器、实时荧光定量PCR仪、PCR仪、凝胶成像仪、电子天平（1/1000）
2.5 甲型H1N1流感病毒的核酸检测
基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。RT-PCR原理是以RNA 为模板经逆转录产生cDNA，再以cDNA为模板进行PCR 扩增以检测目的基因的表达情况。甲型H1N1流感病毒的核酸检测方法包括real-time RT-PCR方法和RT-PCR方法。
2.6 病毒RNA的提取
取咽拭子标本100ul置于1.5ml灭菌离心管中，采用QIAGen RNeasy Mini Kit操作说明提取RNA。取5ul总RNA进行逆转录，其余保存于-70℃。
2.7 real-time RT-PCR检测方法
real-time RT-PCR检测方法检测甲型H1N1流感是用一组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan®探针，对呼吸道样本或体外培养的甲型H1N1流感病毒进行定性检测鉴定。引物和探针序列为美国CDC设计，引物和探针序列如下表：
本实验在BSL―2实验室内进行，所有样本操作均在生物安全柜（BSC）内进行，遵循生物安全三级个人防护。
2.8 RT-PCR检测方法
RT-PCR检测方法的引物序列为国家流感中心设计，引物如下表：
RT-PCR产物的检测采用琼脂糖凝胶电泳技术，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，时间40min，用凝胶成像分析系统分析相应PCR产物的条带。本实验在BSL―2实验室内进行，所有样本操作均在生物安全柜（BSC）内进行，遵循生物安全三级个人防护。
2.9 甲型H1N1流感病毒的鸡胚分离法
甲型H1N1流感病毒的鸡胚分离方法的实验室生物安全级别为BSL-2，实验操作人员进行BSL-3级防护。
网络实验室在收到标本后24h内进行病毒接种。鸡胚分离方法是流感病毒分离方法之一。该方法是将100ul临床标本注入鸡胚羊膜腔，再取100ul临床标本注入鸡胚尿囊腔，在35℃下，进行甲型H1N1流感病毒的培养，2～3天后，获取鸡胚尿囊液和羊水，然后进行红细胞凝集实验和血凝抑制实验鉴定分离物。分离出的病毒株放于-70℃保存。
2.10 结果分析方法
配对设计资料的卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
3 结果
在35例甲型H1N1流感疑似病例中，利用real-time RT-PCR方法检测阳性26例，阳性率为74.29%；利用RT-PCR方法检测阳性24例，阳性率为68.57%；利用鸡胚分离法检出19例，检出率为54.29%；甲型H1N1流感确诊病例共27例（其中一例应用real-time RT-PCR方法检测为阴性，但应用鸡胚分离法可分离出病毒，所以应该是两种方法并联的结果），阳性率为77.14%；（见表1）
表1 三种检测方法的检测情况
利用样本检测资料对real-time RT-PCR检测方法与鸡胚分离法对确诊疾病的灵敏度有无差别进行统计学推断（见表2）。
表2 两种检验方法检验结果的比较
X2=4, P＜0.05，差异有统计学意义，可以认为两种检验方法的灵敏度有差别，鉴于real-time RT-PCR方法阳性率为74.29%，鸡胚分离法检出率为54.29%，可以认为real-time RT-PCR方法灵敏度高于鸡胚分离法灵敏度。
4 讨论
某大学某学院共有学生206名，2009年9月15日至10月15日该大学该学院发生112例甲型H1N1流感疑似病例，均表现有发热，咳嗽，咽痛，流涕，头痛，全身酸痛等症状。从112名甲型H1N1流感疑似病例中采用分层抽样的方法抽取35例，采集其咽拭子送往网络实验室分别运用real-time RT-PCR方法、RT-PCR方法、鸡胚分离法三种方法进行实验室检测。本次检测的35例标本中，运用real-time RT-PCR方法检测阳性26例，阳性率为74.29%；RT-PCR方法检测阳性24例，阳性率为68.57%，因此可知real-time RT-PCR方法比RT-PCR方法灵敏性稍高，可以检测出少量病毒RNA。利用样本检测资料（表2）对real-time RT-PCR检测方法与鸡胚分离法对确诊疾病的灵敏度有无差别进行统计学推断，检验方法为配对设计资料的X2检验，结果为X2=4, P＜0.05，差异有统计学意义，可以认为两种检验方法的灵敏度有差别，鉴于real-time RT-PCR方法阳性率为74.29%，鸡胚分离法检出率为54.29%，可以认为real-time RT-PCR方法灵敏度高于鸡胚分离法灵敏度。出现此现象的原因可能是由于：鸡胚分离法分离病毒可能对样本的要求较高，如样本保存过程中出现失误，造成样本中病毒死亡。病毒分离法可以诊断感染，但由于其耗时长，成本高，因此无法为临床诊断及时提供结果，在突发传染病应急工作中不常用，应用病毒分离法分离出的病毒常常为病例的确诊提供确切证据，病毒分离阴性并不能排除感。
甲型H1N1流感爆发是指1周内，在同一学校(或同一校区、高校同一学院)发现10例及以上聚集性急性呼吸道感染症状者，且其中至少有2例为甲型H1N1流感确诊病例，即判定学校出现甲型H1N1流感暴发疫情[3]。因此，可以判定此次甲型H1N1流感的发生属于暴发流行。本次疫情的暴发历时16天，传播较快，究其原因可能是与学生开学返校，集体生活引起聚集性群体性发病且无保护性抗体有关。此次甲型H1N1流感小范围暴发的首发病例是从Ⅹ市返校的ⅩⅩ同学，ⅩⅩ同学于9月13日返校，9月15日便出现发热（39.2℃），咳嗽，咽痛，头痛，全身酸痛等症状。在此二十多天内，同院便有112名同学有相同症状出现，多有明确接触史。
输入病例指在外地感染，回到本地后发病的病例。本起某大学甲型H1N1流感的首发病例ⅩⅩ为一例输入性病例。二代病例，指在一个家庭、病房、集体宿舍、托儿所、幼儿班组中第一个病例发生后，在该传染病最短潜伏期到最长潜伏期之间，易感接触者中因受其感染而发病的病例。由此可知，本次甲流爆发的大部分病例属于二代病例，反映此次甲型H1N1流感传染性较强。
本次甲型H1N1流感传播如此之快，究其原因可能与学校控制措施不力，造成病例不断成为传染源有关。在甲型H1N1流感流行期间，为控制流感进一步扩散，高校应加强流感的健康教育工作，在学校实行晨、午检，对因病缺课者进行登记追踪，以及适时采取停课隔离等控制措施。由于人群对甲型H1N1流感普遍易感，主要通过飞沫或气溶胶经呼吸道传播，也可通过口腔、鼻腔、眼睛等处粘膜直接或间接传播，所以甲型H1N1流感病毒的生物安全十分重要，即甲型H1N1流感病毒及其样本的采集和储存应遵照世界卫生组织发布的《实验室检测指南》[4]进行。甲型H1N1流感病毒及其样本的运输，实验室活动及风险评估应按照世界卫生组织手册及《引起当前全球疫情的甲型H1N1流感疑似或确诊样本操作实验室生物安全风险管理》推荐技术指南[5]进行，其中样本检测活动应在生物安全二级实验室进行，病毒分离和培养活动应在生物安全三级实验室进行[6]。实验工作人员采取与实验活动相适应的个人安全防护措施，并对其进行必要的健康检查。相关的网络实验室须储备足够的个人防护用品，实验室消毒用品及适量的预防和治疗药物。对实验室产生的相关废弃物的处理必须严格按照我国生物安全管理规定进行。
参考文献
[1] The ministry of health. Circular on issuing “Diagnosis and treatment scheme of pandemic influenza A (H1N1) (The1th edition for pilot use , 2009)” by general office of the ministry of health [EB/OL].
[2] 中华人民共和国卫生部.甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案（试行） [EBS/OL].http//baike baidu com/view/2565527.htm.
[3] 中华人民共和国卫生部.教育部.《学校甲型H1N1流感防控工作方案》.
[4] 中华人民共和国卫生部.甲型H1N1流感诊疗方案试行[S]2009.
[5] 中华人民共和国卫生部.甲型H1N1流感流行病学调查和暴发疫情处理技术指南试行[S]2009.
[6]中华流行病学杂志2003，24（6）：450~453.