摘要：目的：优化天仙子多糖的提取工艺，建立含量测定方法。方法：采用L9(3)4正交试验，以多糖含量为评价指标，确定多糖的提取工艺，并采用苯酚-硫酸法，测定多糖的含量。结果：最佳提取工艺为100℃，加水10倍量回流提取3次，每次1h；葡萄糖的浓度在0.1202 ~0.4206 mg/mL范围内呈良好的线性关系，回收率为99.79%，RSD=0.84%。结论：确定的工艺稳定可行，为天仙子多糖的进一步研究奠定基础。
关键词：天仙子；多糖；含量测定；提取工艺；正交试验
中图分类号：R284.1文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0625-03
Study on the Extraction Technology of Polysaccharides from Hyoscyamus niger L.
ZHANG Wen?jie1，WANG Yan2，YU Xin?wen2，LI Jun3，KANG Ting?guo2，MEN Qi?ming3
(1.Pharmaceutical Department, Shenzhou Hospital, Shenyang Medicial University, Shenyang 110002,Liaoning,China;
2.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600,Liaoning,China；
3 Dalian Institute for Food and Drug Control, Dalian 116021,Liaoning,China)
Abstract:Objective: To optimize the extraction technology and establish the determination method of polysaccharides in Hyoscyamus niger L. Methods: Phenol-sulphate colorimetry was used to determine the content of polysaccharides. According to the yield of polysaccharides, the orthogonal design was used to optimize the extraction technology of polysaccharides. Results: The optimum extraction procedure was adding 10 folds of water, refluxing and extracting at 100℃ for 3 times, 1h for each time. The concentration of polysaccharide was linear in the range of 0.1202~0.4206 mg/mL. The average recovery was 99.79%, RSD=0.84%. Conclusion: The optimum extraction procedure is simple and reliable, which provides a basis for the further study on polysaccharides in Hyoscyamus niger L.
Key words:Hyoscyamus niger L;polysaccharide;determination;extraction technology;orthogonal test
收稿日期：2011-10-21
基金项目：大连市科技局基金资助项目(2009J22DW039)
作者简介：张文杰（1972-），女，吉林柳河人，副主任中药师，学士，研究方向：中药质量标准。
通讯作者：康廷国（1955-），男，内蒙古人，教授，博士研究生导师，硕士，研究方向：中药种质资源与质量评价研究。
门启鸣（1957-），男，辽宁大连人，主任中药师，硕士研究生导师，学士，研究方向：中药质量评价与控制研究，中药质量标准研究。天仙子为茄科植物茛菪Hyoscyamus niger L. 的干燥成熟种子，原称“莨菪子”，性味苦、辛，温，有大毒，具有解痉止痛，平喘，安神的功能。用于脘腹挛痛，喘咳，癫狂[1]。近年来，发现还具有一定的抗癌活性[2-4]。
多糖是由许多个单糖分子聚合而成的一类结构复杂的高分子化合物，广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物的细胞壁中，是构成生命的四大基本物质之一。随着分子生物学及免疫物质的化学研究与发展及新药资源的寻找与开发，对多糖的研究越来越受到广泛的重视。目前已发现的天然多糖有三百多种，在免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗辐射、抗凝血[5-12]等方面发挥着重要的生物活性作用。目前有关天仙子多糖的研究国内外尚未见报道。本实验首次通过正交试验筛选天仙子粗多糖的最佳提取工艺，通过热水回流法提取粗多糖，采用苯酚-硫酸法测定了天仙子中粗多糖的含量，为进一步研究天仙子多糖的药用价值奠定基础。
1材料与仪器
1.1材料
天仙子购于安国杏林药材公司，经辽宁中医药大学康廷国教授鉴定为茄科植物茛菪Hyoscyamus niger L.的干燥成熟种子。
1.2试剂
葡萄糖(中国药品生物制品检定所，含量测定用，批号 110833-200503)，95%乙醇、无水乙醇、苯酚、98%硫酸等试剂均为分析纯。
1.3仪器
R-200型旋转蒸发仪(瑞士BUCHI有限公司)；UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津）；LD5-2A型低速离心机（北京离心机厂）；DZF-6020型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）。
2方法与结果
2.1天仙子多糖的含量测定
2.1.1溶液的制备葡萄糖对照品溶液的配制：称取105℃干燥至恒重的葡萄糖30mg，精密称定，用蒸馏水溶解并定容到100mL。5%苯酚试液的配制：称取5g重蒸苯酚，用重蒸水定容至100mL，置于棕色试剂瓶中，4℃保存。供试品溶液的配制：取天仙子粗多糖50mg，精密称定，用蒸馏水溶解并定容到100mL。
2.1.2测定波长的选择精密量取葡萄糖对照品溶液1.0mL、样品溶液1.0mL，各加入新配制的5%苯酚液1.2mL，混匀，迅速滴加浓硫酸7mL，摇匀，置40℃水浴中放置15min，取出，冷却至室温。另取1.0mL蒸馏水同法平行操作，作为空白对照，于500~400nm范围内扫描其吸收曲线，见图1、2。结果两种溶液在(490±2)nm波长处均有最大吸收，故以490nm为测定波长。
图1葡萄糖可见光谱扫描图图2样品可见光谱扫描图2.1.3苯酚加入量的选择分别精密量取葡萄糖对照品溶液1mL共7份，按苯酚-硫酸法，分别加入苯酚0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，加入浓硫酸5mL，在490nm测定其吸收度，结果表明：苯酚加入量为1.2mL时，反应基本完全，故苯酚加入量确定为1.2mL。
2.1.4硫酸加入量的选择分别精密量取葡萄糖对照品溶液1mL共7份，按苯酚-硫酸法，分别加入苯酚1.2mL，加入浓硫酸4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5mL，在490nm测定其吸收度，结果表明：浓硫酸加入量为7mL时，反应基本完全，故浓硫酸加入量确定为7mL。
2.1.5标准曲线的制备精密量取葡萄糖标准溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL分别置于10mL具塞刻度试管中，各加入5%苯酚溶液1.2mL，充分摇匀，然后加浓硫酸7mL，充分摇匀，再加蒸馏水至刻度，充分摇匀。另取1.0mL的蒸馏水同上操作制得空白溶液。在490nm波长处测定吸收度值，得标准回归方程为Y=1.6334X+0.0283（r=0.9997），表明样品在此范围内线性关系良好。
2.1.6稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0、15、30、60、120min，测定吸收度，结果表明，在2h内基本无变化。
2.1.7重现性试验取同一批样品6份，分别测定吸收度，计算含量，结果测得含量的RSD为0.15%。
2.1.8加样回收率试验精密称取已知含量的样品，共5份。分别加入葡萄糖对照品约5 mg，定容至50 mL，按“2.1.5”项下方法操作，结果平均回收率为99. 79%， RSD为0.84%。
2.2提取工艺的优选[13]
取天仙子药材粉碎，过3号筛，精密称取粉末约10g，4份，置具塞锥形瓶中，分别按下述4种方法进行提取。方法1：加水8倍量，回流提取3次，每次1h，滤过，合并提取液，备用；方法2：加水8倍量，浸提24 h，滤过，备用；方法3：加95%乙醇6倍量，回流提取2次，每次1h，弃去醇液，药渣加水8倍量，回流提取3次，每次1h，滤过，合并提取液，备用；方法4：加95%乙醇6倍量，回流提取2次，每次1 h，弃去醇液，药渣加水8倍量，浸提24h，滤过，备用。
取上述备用提取液均浓缩至50 mL，加95%乙醇300 mL，静置过夜，离心(3000r/min，15min)，取沉淀，分别依次用95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤数次，置真空干燥箱中50℃真空干燥5h，至天仙子粗多糖重量不再变化，精密量取天仙子粗多糖50mg，用蒸馏水溶解并定容到100mL，按“2.1”项下的多糖含量测定方法进行测定，并计算含量，结果多糖含量分别为1.396%、0.574%、1.979%、0.913%。由此可见，方法3的多糖含量高于其他3种方法，故确定方法3为最佳提取方法。
2.3正交试验
2.3.1正交设计与结果影响水提取多糖的因素很多，结合预实验结果，选择4个主要因素，即：加水量、提取时间、提取温度、提取次数，每个因素各设定3个水平，按4因素3水平进行L9(3)4正交试验，因素与水平见表1。取天仙子药材粉碎，过3号筛，精密称取约100g，以95%乙醇6倍量回流提取2次，脱脂，每次1h，滤过，挥干溶剂，得药渣81.50g，得率81.5%。取上述药渣共9份，各9g，分别置于250mL具塞锥型瓶中，按表2的条件进行提取，滤过，合并滤液，并浓缩至50mL，加95%的乙醇300mL，搅拌，4℃过夜，离心（3000r/min，15min），沉淀依次用95%乙醇、无水乙醇、丙酮反复洗涤，真空干燥，得天仙子粗多糖，按“2.1”项下方法进行测定，并计算含量，结果见表2。
表1因素水平表
水平A料液比/
（倍）B提取时间/
（h）C提取温度/
（℃）D提取次数/
（次）16160128 1.5802310 210032.3.2正交试验结果分析方差分析结果见表3。从表2、表3可知，影响天仙子多糖提取率的因素的顺序均是：C>A>D>B。其中方差分析显示，C即提取温度对天仙子多糖提取的影响较大；直观分析的多糖提取最佳工艺为A3B3C3D3，但B项影响因素较小，B1，B2与B3结果均相当，考虑到节约时间，最终确定最佳工艺A3B1C3D3，即加水10倍量水、100℃回流提取3次、每次1h。
表2正交实验结果表
编号ABCD多糖含量（%）111111.473212221.763313332.201421231.755522311.962623121.539731322.089832131.813933211.853K11.8121.7731.6081.736K21.7521.8461.7911.797K31.9181.8642.0841.923R0.1660.0910.4760.160表3方差分析结果
方差来源偏差平方和自由度F值显著性A0.04223.000B0.01421.000C0.346224.714*D0.04323.0710.012注：F0.05(2，2)=19.00，*P [7]Lin C. L., Wang C. C., Chang S. C., et al. Antioxidative activity of polysaccharide fractions isolated from Lycium barbarum Linnaeus [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2009, 45: 146-151.
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