[摘要] 目的 通过桑仙降压颗粒对自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR） CD34和AS蛋白光密度值的干预，探讨其对微血管数目及血管新生抑制因子的作用及机制。 方法 SHR随机分为3组，蒸馏水空白对照组、吲哒帕胺西药对照组、桑仙降压颗粒组，以Wister 大鼠为正常对照，4周及8周后观察SHR心肌AS蛋白光密度及CD34的表达。 结果 相较空白对照组，4周及8周后桑仙降压颗粒组CD34表达均明显增多且心肌AS蛋白光密度值明显降低。 结论 桑仙降压颗粒能有效减轻SHR大鼠微血管损害，其机制之一可能与降低AS蛋白密度表达有关。
[关键词] 自发性高血压大鼠；桑仙降压颗粒；CD34；AS 蛋白
[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）03（c）-0022-04
The Intervention study of Sang Xian Jiang Ya Granule on epression of myocardial CD34 and endostatin（AS） protein optical density of spontaneously hypertensive rats
ZHANG Yunhui
Shandong University of Traditional Chinese Medicine in Shandong Province, Ji"nan 250355, China
[Abstract] Objective To observe the effect of Sang Xian Jiang Ya Granule(SXJYG) on spontaneously hypertensive rats(SHR) myocardial CD34 and endostatin (AS) protein optical density values, and investigate the intervention of SXJYG on microvascular number and angiogenesis inhibiting factor. Methods SHR were randomly divided into 3 groups: those gavaged by distilled water as the control group, those gavaged by indapamide as the control group of Western Medicine, SXJYG group, compared with wistar as normal control group. After 4 and 8 weeks, the expression of myocardial AS protein and CD34 were observed. Results Compared with the blank control group, after 4 and 8 weeks SXJG group CD34 expression were significantly increased but myocardial AS optical density value were decreased. Conclusion SXJXG can reduce the SHR rat microvascular damage, and one of its mechanisms may be related to the decrease of AS protein expression in relation to density.
[Key words] Spontaneously hypertensive rats; Sang Xian Jiang Ya Granule; CD34; AS protein
高血压是最常见的心血管病，是全球范围面临的重大公共卫生挑战。高血压不仅发病率高，还常常引起严重的心脑肾并发症，是心脑血管事件的主要危险因素之一，成为致死、致残的重要原因。可见，大力开展高血压的发病机制、防治研究已刻不容缓[1]，研究方法众多，然其机制鲜有从微血管入手，因此本研究通过观察桑仙降压颗粒对SHR心肌CD34及AS的影响，观测其对SHR微血管密度及AS蛋白光密度的干预并作相关机制分析，以期对积极探索预防靶器官损害起到推动作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物与分组 4周龄Wistar大鼠18只，雌雄各半，体重210～250 g，由山东医科大学动物室提供[动物合格证号：SCXK（鲁）20090001]。以A标示正常对照组即Wistar大鼠组；4周龄SHR，雌雄各半，体重200～240 g，由中国医科院阜外心血管医院提供（医动字第01-108号），42只，B、C、D分别标示SHR不同的给药方式，B：SHR给予蒸馏水为空白对照组，C：SHR给予桑仙降压颗粒为实验组，D：SHR给予吲哒帕胺为西药对照组；观测事项点：0组的观测时间为Wistar大鼠、SHR4周龄；1、2的观测时间为Wistar大鼠、SHR给药后4周、8周。在3个观测时间点分别观测A0、B0；A1、B1、C1、D1；A2、B2、C2、D2，根据不同观测时间随机分组，每组６只。
1.1.2 药物 桑仙降压颗粒组方有桑寄生、淫羊藿、丹参、川芎等，由山东中医药大学中药制剂室按正交试验法优选工艺制成，每克含生药6 g，临用前加蒸馏水稀释成含生药0.8 g/mL的药液。吲哒帕胺片2.5 mg/粒，由天津力生制药股份有限公司提供，实验前加0.9%氯化钠溶液适量，制备成浓度0.025 mg/mL混悬液，置4℃冰箱保存备用，使用前振荡，充分摇匀。
1.1.3 试剂 Anti-AS，英国abcam公司产品；CD34抗体、生物素化山羊抗兔IgG，链霉亲和素2生物素（SABC）和DAB 显色剂，均由武汉博士德生物工程有限公司提供。
1.1.4 实验仪器 METTLER AE20型电子分析天平，海特勒托利多仪器有限公司提供；康乐电热恒温水浴槽，上海医疗器件七厂提供；光学显微镜，由山东省中医院病理科提供。
1.2 方法及检测
1.2.1 制备 用戊巴比妥钠（40 mg/kg）体重腹腔注射，麻醉后立即经腹主动脉注入4℃ 0.9%氯化钠溶液，切开下腔静脉放血，待冲洗液干净无色后，立即开胸，快速分离、摘取心脏，置入4℃ 0.9%氯化钠溶液中快速冲洗3次。
1.2.2 CD34标记MVD 采用免疫组化SP法。结果判断：参照AXIOTIS等[2]的标准，由两位病理医生采用盲法（独立检测）在高倍镜（×400）下读片。每张切片高倍镜下随机选取10个不重复的视野（不足10个视野的，按实际观察到的视野计数），共纪录1 000个细胞，综合染色强度和阳性细胞数量进行判定。（1）按切片中细胞着色深浅评分：0分为细胞无显色；1分为黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色。（2）按阳性细胞数占同类细胞数的百分比评分：1分为50%且≤75%；4分为>75%。取 （1）、（2）两项评分的乘积作为总积分：0～3分为（-）；>3分且≤6分为（+）；>6分且≤9 分为（+ +）；>9 分（+ + +）。（-/ +）为低表达，（+ +/+++）为高表达。
1.2.3 AS蛋白光密度的表达 每张切片高倍镜下随机选取10个不重复的视野（不足10个视野的，按实际观察到的视野计数），共记录1 000个细胞。其结果判定同CD3。
1.3 统计学分析方法
计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，数据采用SPSS 17．0进行数据处理及相关性分析，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 CD34表达
实验前，空白对照组大鼠微血管数与正常对照组相比差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。实验4周，空白对照组大鼠微血管数减少，与正常对照组相比差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。与空白对照组比较，试验组与西药对照组微血管数均有增多趋势，但差异无统计学意义（P ＞ 0．05）。实验8周，空白对照组大鼠微血管数明显减少，与正常对照组相比差异有统计学意义（P ＜ 0．01）。与空白对照组比较，试验组与西药对照组CD34表达均明显增多，差异有统计学意义（P ＜ 0.01），但两组间相比差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。数据结果见表1。见图1 ~10。
2.2 AS蛋白光密度的表达
实验前，空白对照组大鼠AS蛋白光密度值与正常对照组相比差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。实验4周，空白对照组大鼠AS蛋白光密度值升高，与正常对照组相比差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。与空白对照组比较，试验组与西药对照组AS蛋白光密度值均有降低趋势，但差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。实验8周，空白对照组大鼠AS蛋白光密度值明显升高，与正常对照组相比差异有统计学意义（P ＜ 0.01）。与空白对照组比较，试验组与西药对照组AS蛋白光密度值均明显降低，差异有统计学意义（P ＜ 0.01），但两组相比差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。数据结果见表2，见图11~20。
3讨论
高血压研究部位多着重于大中动脉，血压形成的主要因素是内径小于300 μm的微动脉所形成的外周阻力，同时，微血管担负组织器官的物质转运功能[3]，因此，微血管数目的改变直接影响着高血压的预后及靶器官的损害，微血管保护成为高血压靶器损害的重要途径之一。但对高血压微血管损害的文献报道却极少[4-5]。
选择良好的血管内皮标志物计数微血管，判定血管生成状况，有助于治疗性血管新生方法的实施。在所选的血管内皮标志物如Ⅷ因子相关抗原，CD31和CD34抗原中，以CD34抗原特异性最高，被认为是最敏感的血管内皮标志物，利用CD34抗体进行免疫组化染色可测量缺血组织微血管密度和面积，检测早期新生血管的形成[6]。
AS是血浆蛋白纤维溶解酶原的内部片段，是近年来发现的最为有效的血管生成抑制剂之一[7]。血管抑素的抗血管形成作用机制目前还不十分明确，据报道有如下观点：有研究表明，血管抑素可与内皮细胞表面ATP合成酶的a亚单位结合，干扰整合素介导信号传导，从而产生抗血管生成作用及下调内皮细胞的增生和移行作用[8]。Lucas R[9]的实验证实，血管抑素抗血管生成作用与其诱导的内皮细胞凋亡有关；而Gfiscelli F等[10]则认为血管抑素干扰了G/M转换，下调了M期的磷酸化，通过阻止有丝分裂，而阻断内皮细胞的增殖作用。
故本研究以观测标识微血管密度的CD34及心肌AS蛋白光密度值表达为视角，发现4周龄SHR已出现CD34表达减少，并随增龄而加重，同时我们还观察到SHR心肌AS蛋白光密度值升高，并随周龄增加而显著升高，桑仙降压颗粒、吲哒帕胺用药4周后，均可增加CD34表达、降低AS蛋白密度值，实验8周后，两药仍具显著作用。由此可见CD34表达与AS光蛋白表达呈负相关，降压疗效确切[11]的桑仙降压颗粒能有效减轻高血压的微血管数目减少，其机制可能与其增加CD34蛋白表达而降低AS表达密切有关，三者之间的密切关联性尚待进一步研究。
[参考文献]
[1] 中国高血压防治指南起草委员会. 中国高血压防治指南[J]. 高血压杂志，2000，8（1）：94-102．
[2] Abraham JA，Mergia A，Whang L，et al. Nucleotide sequence of a bovineclone encoding the angiogenic protein， ba2sic fibroblast growth factor [J]. Science，1986，233：545.
[3] 骆秉铨，韩冰，林荣，等． 高血压病人阻力动脉重构和微血管功能障碍[J]. 中国微循环，2005，9（6）：414-416．
[4] Taddei S，Virdis A，Ghiadoni L，et al. Endothelial dysfunction in hypertension[J]. J-Nephrol，2000，13（3）：205．
[5] Struijker-Boudier HA． Arteriolar and capillary rem odelling in hypertension[J]. Drugs，1999，59 ：37．
[6] 朱惠斌，陈懿，谭琥，等. 脑泰方提取物对局灶性脑缺血大鼠CD34 表达的影响[J]. 中药新药与临床药理，2011，22（2）：141-144.
[7] Reilly MS，Holmgren I，Shing Y，et al． Angiostatin：a n0vela“giogenesi inhibitor that mediates the suppression of metastase sby a Lewis lung car- cinoma [J]. Cell，1994，79（21）：315-328．
[8] 刘颖． 血管抑素、内皮抑素与肺癌关系的研究进展[J]. 中国肿瘤杂志，2000，3（4）：317-320．
[9] Lucas R，Holmgren L，Garcia I，et al． Multiple forms of anglo statin in- duce apoptosisin endothelial cells[J]. Blood，1998，92（12）：4730-4741．
[10] Gfiscelli F，Li H，Bennaceur-Griscelli A，et al． Angiostatin gene transfer： inhibition of tumor growth in vivo by block anglo statin of endothelial cell proliferation associated with a mitosis arrest [J]. Pmc Natl Aead Sci USA，1998，95（11）：6367-6372．
[11] 张蕴慧. 桑仙降压颗粒对高血压病病人血压和内皮功能的影响[J]. 中西医结合心脑血管病杂志，2004，2（9）：497-499.
（收稿日期：2012-01-05）