【中国分类号】 R71.23【文献标识码】 A【文章编号】 1044-5511（2012）02-0538-01?? 单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis , SCGE),是由Ostling 建立经Singh 等改进的一种检测有核细胞DNA 损伤的技术。其原理是包埋在琼脂糖凝胶中的细胞经裂解和解螺旋,使断裂的DNA 碎片进入凝胶,在电场作用下,带负电荷的DNA 断片向阳极迁移,形成彗星影像。由于该方法具有敏感、简便、快速、稳定、低耗等优点,广泛应用于遗传毒理、环境监测和细胞凋亡等的研究。闫海张崇华?
1. 实验方法及操作要点?
1．1 分离制备细胞悬液:单细胞凝胶电泳既可用于体外培养的细胞株，有可用于体内脏器细胞。体外培养的细胞株先用胰酶消化,吹打成单细胞悬液。体内脏器细胞则处死动物,取出脏器,于Hanks′液中制备成单个细胞悬液。细胞浓度是关键，如果细胞浓度过低或过高都很难完成100个彗星计数分析。样品应置4℃环境下避光进行,以抑制或降低核酸内切酶等活性,阻止DNA损伤的修复,从而达到准确地检测DNA初级损伤。已有研究表明一些细胞DNA断裂损伤能在1 h内达到90%的修复, 3 h达到97% ,因此,应严格控制细胞在分析过程中的温度。?
1．2 胶板制备:取30～50μl于56℃水浴中保温的0.5%普通熔点琼脂糖,铺于磨沙载玻片上,形成底胶。取120～150μl 0.5%普通熔点琼脂糖加在底胶上,再于其上加盖玻片, 4℃冷凝10 min。取下盖片,取70～100μl于37℃水浴中保温的1.0%的低熔点琼脂糖与70～100μl细胞悬液(105个细胞/ml)混匀,立即铺片,加上盖玻片, 4℃冷凝10 min。去掉盖玻片, 取70 ～100μl于37℃水浴中保温的0.5%的低熔点琼脂糖铺片,加盖玻片, 4℃冷凝。该实验需要制备两层琼脂糖凝胶薄板,应注意琼脂糖的浓度、制备时间和温度。第1 层放置于4℃制备时间约20 min,如时间过短或过长,均可造成实验失败;第2层凝胶是1%低凝点(24-26) ℃琼脂糖液,放置的温度为30℃～37℃,温度过高引起细胞损伤,此过程要快,以免引起细胞DNA的修复加速［1］。?
1．3 细胞裂解与电泳:将制备好的胶板去掉盖玻片后,浸于4℃预冷的细胞裂解液中,裂解1 h。取出胶板,放入电泳槽中,浸泡在4℃电泳液中解旋30 min。电泳时电压、电流及时间的长短会直接影响DNA 迁移长度,造成假阳性或假阴性。建议采用稳压25 V 或稳流300 mA ,电泳30 min。电泳进行中应持续监测,吸出或加入电泳液,调节液面高度,保持电压与电流的恒定。?
1．4 中和与染色:电泳结束,将胶板浸泡于中和液中中和两次,每次15 min, ,取出胶板,暗处染色20 min。?
2. 镜检和图像分析?
随着SCGE技术的发展,图像分析软件的出现使一些无法用肉眼测量的指标如,尾矩、尾部DNA 含量等得到检测，结果也更精确，拓展了检测范围。目前,除了昂贵的商业软件（英国的KOMET 与德国的KS400）外,也出现了一些免费的分析软件。国外常见的免费软件有Sicion Image 和CASP ,有数据表明这2 个软件分析指标有很好的相关性［2］。Helma 等所设计的软件(Sicion Image) 能测量彗星强度、尾长、头面积、尾面积、尾部DNA 含量、尾矩等多项参数,而且该软件可根据需要进行修改,并具有操作简便、快捷的优点［3］ 。Konca 等在Helma的基础上研制了另一软件(CASP) ,该软件可在多种硬件及软件平台上运行,所测量的彗星参数中增加了Olive 尾矩,而且用户界面更方便［4］ 。在锁定要分析的细胞后能同时自动分析13 项指标,克服由于主观因素而产生的误差,简化了操作并与SPSS 统计软件有很好的兼容性。除了国外免费的分析软件外,国内朱正良等研制的彗星图像分析软件( IMI) 也具备了上述软件的优点,而且在中文界面下使用起来更舒适便捷［5］ 。Bocker 等研制的分析系统能自动识别细胞,并自动对彗星进行分类并定量,大大提高了彗星图像的分析速度,15 分钟内能分析100个彗星图像［6］，减少人为因素的干扰 。?
3. 应用?
SCGE 是检测DNA 损伤快速、简便、敏感、经济的方法。该方法不受染色体的大小和数目的影响。与其它检测方法相比，SCGE 技术具有所需细胞数目少，实验耗时短、耗费低、应用简便、灵活性高以及可用于分析非增殖型细胞等优点。一些国外研究表明， SCGE是目前短期遗传毒性检测中最灵敏的方法，具有广阔的应用前景。??
参考文献?
［1］ 王兰，刘心荣. 单细胞凝胶电泳技术的应用和发展［J］. 中国卫生检验杂志,2008 ,18 (12) :2829-2831.?
［2］ 邢彩虹,李桂兰,纪之莹,等. 单细胞凝胶电泳图像分析软件的比较［J］. 毒理学杂志, 2005, 19 (2) : 141 - 143.?
［3］ Helma C , Uhl M. A public domain image analysis programfor the single cell electrophoresis (comet) assay , Mutat Res ,2000 ,466 :9-15.?
［4］ Konca K, Lankoff A , Banasik Anna , et al . A cross2platform publicdomain PC image2analysis program for the comet assay. Mutat Res ,2003 ,534 : 15-20.?
［5］ 朱志良,庄志雄,黄钰,等. 单细胞凝胶电泳图像分析系统的研制及应用［J］. 中华劳动卫生职业病杂志,2001 ,19（4）：298-300. ?
［6］ 邢彩虹，李桂兰，尹松年。单细胞凝胶电泳技术及其应用进展［J］.卫生研究，2004，33（9），638-640.