【摘要】 目的 探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUMSCs)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠急性肺损伤(ALI)氧化应激失衡的作用。 方法 人脐带间充质干细胞的分离，培养和鉴定。将30只Wistar大鼠随机分为生理盐水(NS)对照组(A组)、LPS模型组(B组)和HUCMSCs移植组(C组)，每组10只。移植6h后，处死各组大鼠，取肺组织行病理学观察，肺湿/干重比测定，丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性检测。 结果 流式细胞术结果显示，纺锤样细胞高表达 CD29、CD44和CD105，极低表达CD34，符合HUMSCs的特征。与A组比较,B组W/D和MDA含量明显升高(P［1］。Lima等［2］证实氧化应激在肺损伤模型的结构，功能和炎症反应中扮演很重要的角色,这提示氧化应激在肺损伤中扮演了重要的角色。?
在动物实验中已经证实,骨髓间充质干细胞(BMDMSC)有修复博来霉素诱导的肺损伤的能力［3,4］。骨髓间充质干细胞是目前细胞移植较常用的种子细胞,但年龄因素对其增殖分化能力影响较大,病毒感染率高,获取为有创操作过程,且含量低等缺点［5］,使得寻找新的种子细胞成为当前研究的热点.脐带间充质干细胞的发现［6］为急性肺损伤提供了新的种子细胞。之前的研究证明干细胞移植后不仅具有分化能力,还具有免疫调节等功能,但是国内外罕有HUMSCs是否对氧化应激有影响报道。因此，本实验以气道内滴注LPS复制大鼠ALI模型，探讨HUMSCs在ALl氧化应激失衡中的可能作用。?
1 资料与方法?
1.1 一般资料 ?
1.1.1 试剂 胎牛血清(四季青生物，中国),DMEM/F12液体培养基(GIBCO，美国),脂多糖055：B5(Sigma，美国),丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)试盒剂(建成生物，中国)?
1.1.2 动物及分组 30只健康Wistar大鼠，鼠龄12周,雌雄不拘,体重(200±20)g,购自山西医科大学动物实验中心。实验前大鼠常规禁食12 h，自由饮水。随机将动物分为NS对照组、LPS模型组和HUCMSCs移植组，每组10只。模型组和移植组大鼠尾静脉注射5 mg/kg LPS建立急性肺损伤模型，造模成功30 min后，干细胞移植组尾静脉注射HUCMSCs悬液1 ml(细胞数1×105)，NS对照组、肺损伤模型组同法给予等量生理盐水。?
1.1.3 人脐带间充干细胞的分离、培养与鉴定 脐带采集经供者同意并已签署知情同意书。用PBS冲净残留的脐带血，用眼科剪剪碎。将组织块均匀的接种于75 cm3的培养瓶中，加入体积分数10%FBS和100U/ml双抗(青链霉素)的DMEM/F12培养液约5 ml，放于37℃，5% CO2培养箱内培养，24 h后添加培养液。每3 d半量换液一次，逐渐去除未贴壁细胞。约20 d后待细胞80%融合时，用0.25%的胰蛋白酶消化，按2?∶?1的比例传代培养，每2 d换液一次，直至80%融合再次传代。取第4代用于移植。流式细胞仪鉴定表面标志。?
1.2 方法 ?
1.2.1 大鼠急性肺损伤造模 LPS模型组：10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔内注射麻醉大鼠,气道内滴注LPS 5 mg/kg。ALl模型复制成功后观察大鼠可见口唇灰紫，麻醉苏醒后精神萎靡，呼吸频率明显加快，活动减少,皮毛耸立。?
1.2.2 病理学观察 左肺组织以10％多聚甲醛浸泡48 h，脱水、石蜡包埋，切片，用苏木精?伊红(HE)染色后，光镜下观察。?
1.2.3 肺湿/干重比测定 各组大鼠开胸取右肺中叶，滤纸吸干，称取湿重(W),置70℃恒温箱48 h,烘干至恒重，称取干重(D),计算肺组织湿重/干重(W/D)。?
1.2.4 肺组织匀浆中丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性测定
剩余肺组织制备组织匀浆，硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA的含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD的活性,具体步骤按试剂盒说明书进行。?
1.2.5 统计学方法 采用SPSS 15.0统计软件进行分析，数据以(x±s)表示，各组间差异采用单因素方差分析，两两比较采用LSD?t检验，P［7］。已应用于大量疾病研究当中，如治疗乳腺癌［8］、肺纤维化［9］和帕金森病［10］。HUMSCs是目前最有应用前景的种子细胞。最近的研究证实,MSCs的这种作用是一种旁分泌效应, 表现为短暂性的释放抗炎症因子, 刺激了内源性的修复, 而不是移植的MSCs再生或者分化后修复了损伤组织。?
人体在代谢过程中产生多种自由基，发挥解毒、 清除病原微生物及参与生物合成等生理作用。但在病理状态下，自由基产生和清除失控，过量的自由基则作为致病因子损伤组织和细胞。MDA是检测体内脂质过氧化程度的客观指标，而SOD含量高低间接反映机体清除氧自由基的能力。实验结果显示,B组注射LPS后6h产生了明显的肺损伤，同时机体抗氧化应激能力显著下降。B组肺组织中MDA含量显著高于A组，肺组织内SOD活性显著低于A组。说明LPS所致的肺损伤使肺部发生了强烈的氧化应激。强烈的氧化应激不仅可直接损伤肺泡上皮及肺泡毛细血管内皮细胞，还可通过肺部脂质过氧化反应产生新的氧自由基以多种方式参与肺泡毛细血管内皮细胞的损伤，导致肺损伤。正常情况下，机体抗氧化系统可以清除过多的氧自由基，使机体不会被氧自由基损伤；而LPS损伤时，肺部发生强烈的氧化应激，机体抗氧化应激能力不足，说明二者的失衡参与了肺损伤。本研究证明HUMSCs能一定程度上控制这种氧化应激。这与Araceli等［11］在试管内hMSCs能清除活性氧(ROS)和活性氮(RNS)，并能有效地控制氧化应激的研究是一致的。Simta等［12］的研究也已经证实在活体内注射BMDMSC能改善内毒素诱导的小鼠急性肺损伤模型组织中的氧化还原状态。?
综上所述，HUMSCs能显著改善LPS诱导的大鼠ALI肺组织病理学改变及肺损伤程度，并减少肺组织内MDA的含量，提高肺组织内SOD的活性，从而明显减轻LPS诱导的大鼠ALI程度。?
参 考 文 献?
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