[摘要]目的：探讨乙酰水杨酸（acetylsalicylic acid ASA）在UVB诱导黑素细胞树突形态相关分子Rac1和RhoA表达中的作用。方法：培养正常人表皮黑素细胞系PIG1细胞，将细胞以一定密度接种于平皿中，并随机分为三组，对照组、100mJ UVB照射组及UVB照射后ASA处理组。ASA处理24h后采用RT-PCR 检测Rac1和RhoA mRNA表达的变化及Western blot检测蛋白表达的变化。结果：PIG1细胞经100mJ UVB照射后与对照组相比，促进树突形成的Rac1表达较对照组明显增高，而抑制树突形成的RhoA表达下调；ASA处理可反转UVB照射对Rac1和RhoA的作用， Rac1表达较UVB照射组明显降低，而RhoA表达增高。结论：一定剂量UVB照射后，黑素细胞Rac1表达增高，RhoA表达下调；ASA可以抑制一定剂量UVB照射诱导的黑素细胞树突形态相关分子的改变。
[关键词]黑素细胞；UVB照射；ASA；树突；Rac1；RhoA
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）04-0587-03
Effect of ASA on the expression of the dendrites regulating factors Rac1 and RhoA in melanocytes induced by UVB irradiation
HUI Kun,JIAN Qiang,XUE Ke,ZHU Dong-ning,AN Qing,LI Cheng-xin
(Institute of Dermatology,Xijing Hospital,the Fourth Military Medical University,Xi"an 710032,Shaanxi,China)
Abstract: Objective To investigate the effect of acetylsalicylic acid (ASA )on the expression of the dendrites regulating factors Rac1 and RhoA in melanocytes induced by UVB Irradiation. Methods Melanocytes cultured in plates were divided into 3 groups, control group, 100mJ UVB irradiation group and UVB irradiation plus ASA treatment group, respectively.The mRNA expression of Rac1 and RhoA was analysed with real time RT-PCR, and protein expression was assayed by western blotting. Results Compared with control group, UVB irradiation enhanced the protein and mRNA expression of Rac1,while decreased the expression of RhoA. However, ASA treatment could inhibit the influence of UVB irradiation on the Rac1 and RhoA. The protein and mRNA expression of Rac1was decreased obviously and expression of RhoA was enhanced after treatment with ASA. Conclusions UVB irradiation can increase the expression of Rac1 and decrease the expression of RhoA in melanocytes and ASA can suppress these change induced by UVB irradiation.
Key words:melanocyte;UVB irradiation;ASA;Rac1;RhoA;dendrites
色素沉着的过程十分复杂，其中黑素的合成与转运是最为重要的两个环节。UVB照射不仅能够增加黑素合成，本课题组先前的实验证明其还可以明显促进黑素小体的转移及转运。目前有研究表明，乙酰水杨酸（acetyl salicylic acid，ASA）具有淡化色斑的作用，但ASA是否能够影响UVB诱导的黑素小体的转运尚不清楚。本实验检测ASA对UVB诱导黑素细胞树突形态相关分子的影响，探讨ASA在黑素小体转运中的作用。
1 材料和方法
1.1材料：永生化的人表皮黑素细胞系PIG1来自美国艾利诺斯州Loyola医学中心，254培养基、HMGS添加剂（Cascade Biologics公司），标准胎牛血清、Trizol核酸提取液（GibcoBRL），ASA、胰蛋白酶（Sigma公司），RT-PCR试剂盒（Takara公司），BCA蛋白定量检测试剂盒（Pierce公司），兔抗人Rac1单抗、鼠抗人RhoA单抗（abcam公司），山羊抗鼠二抗（HRP）（北京中山生物技术有限公司），紫外线光疗仪（上海希格玛公司），辐照度以UVB辐照度监示器标定，UVB剂量=UVB辐照度×时间(s)，均为单次照射。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养与分组：取对数生长期的PIG1细胞消化后以5×105/ml的密度接种于直径6mm的平皿，随机分为三组：第一组为对照组，第二组为100mJ UVB照射组，第三组为100mJ UVB照射后即刻给予ASA处理组。具体过程如下：细胞培养至80%融合时吸出254培养液，PBS清洗后，再加入1ml PBS后给予UVB照射，吸出PBS，加入原培养液，第三组原培养液中加入ASA使其浓度为100μM，继续培养24h。
1.2.2 MTT法测定生长曲线：取接受不同浓度ASA处理后的PIG1细胞进行MTT比色试验，每孔加入20?l 5mg/m1的MTT溶液终止培养，在CO2孵箱中继续培养4h后吸去培养液，再每孔加入150μl DMSO，充分振荡培养板10min，酶标仪在490nm波长下测定各孔吸光度值。
1.2.3 Western blotting 方法检测蛋白表达水平：收集各组细胞后提取蛋白，进行Western blotting检测 Rac1和RhoA的表达变化
1.2.4 RNA 抽提与定量RT-PCR：细胞总RNA 提取依照Trizol试剂盒方法进行。 Rac1引物：上游引物 CAAGTGTGTGGTGGTGGGAG下游引物TCTGTTTGCGGATAGGATAG，扩增片段为77bp；RhoA引物：上游引物GACTCGGATTCGTT GCCTGA下游引物TGGGAACTGGTCCTTGCTGA，扩增片段为324bp。PCR反应条件为：预变性95℃ 30s，变性95℃ 5s，延伸68℃ 30s，共35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。反应结束后确认扩增曲线，溶解曲线和Cr值。采用Livak法以β-actin为标准对结果进行相对定量分析。
1.2.5 统计学分析：实验数据用x±s表示，照射组与对照组及照射组间比较采SPSS12.0进行单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05时认为差异有统计学意义。
2 实验结果
2.1 ASA对细胞活性的影响：不同浓度ASA处理黑素细胞24h后，以药物浓度为横轴，以490nm波长下吸光度值为纵轴绘制图表。细胞活性检测结果显示当ASA的浓度在100μM以内对细胞活性没有影响，而当ASA浓度超过500μM时细胞活性降低,但无统计学意义，当处理浓度为2 500μM时细胞活性明显降低，并有统计学意义（P＜0.05）(图1)。
2.2 ASA对Rac1，RhoA蛋白表达的影响：不同处理组中Rac1，RhoA的蛋白表达变化：经100mJ UVB照射后与对照组相比Rac1蛋白表达显著增加，RhoA表达显著下降；100mJ UVB照射后即刻给予100μM ASA组与单纯UVB照射组相比Rac1蛋白表达显著降低，RhoA表达显著增高(图2)。
2.3 ASA对Rac1，RhoA mRNA表达的影响：100mJ UVB照射组与对照组相比Rac1 mRNA表达显著增加，而在照射后即刻给予100μM ASA组其表达明显下降(图3)；100mJ UVB照射组与对照组相比RhoA mRNA表达显著降低，而在照射后给予100μM ASA组其表达明显增加(图4)。
3 讨论
3.1 黑素细胞分布于表皮基底层，其主要功能是产生黑素，并将其转运到邻近的角质形成细胞。因此树突是黑素细胞形态学的重要特征性标志，它形成树枝状分叉，朝邻近的角质形成细胞生长，以使黑素细胞将黑素输送给它们[4]。黑素细胞可以通过增加其树突数量和长度而更有效地向其邻近的角质形成细胞转运黑素，使色素沉着增加。树突在黑素转运中起着至关重要的作用，其本身又受到许多因素的调节使其自身的形态结构发生改变。其中，关键调控因子是Rho蛋白家族的RhoA和Rac1。Scott等研究发现，RhoA和Rac1在黑素细胞肌动蛋白细胞骨架和树突形成方面起重要作用[2]。在黑素细胞内，活化Rac1可以促进树突的形成和延伸，而RhoA具有相反的作用[6]。
3.2 乙酰水杨酸，是环氧合酶的非特异性抑制剂，具有解热、镇痛、抗炎、抗风湿、抗肿瘤等作用[7-8]。有研究发现ASA具有淡化炎症后色素沉着的作用。有文献报道COX-2抑制剂能抑制αVβ3调节的Cdc42/Rac依赖的内皮细胞的迁移[3]，但Cdc42/Rac并不只与细胞的迁移相关，还与黑素细胞树突的数量以及形态密切相关，提示COX-2可能通过调节Cdc42/Rac的表达而调控黑素细胞树突形态以及数量。
3.3 本研究发现，ASA可以抑制UVB照射引起的人黑素细胞系PIG1中Rac1的高表达；并可以改变UVB照射引起的人黑素细胞系PIG1中RhoA的低表达，表明ASA能够影响黑素细胞树突形态因子RhoA和Rac1的表达，进而影响树突的形成及功能，减少黑素小体转运，从而发挥淡化色斑的作用。
[参考文献]
[1]朱东宁,简强,薛柯,等. UVB照射对黑素细胞树突形态调控因子Rac1和RhoA表达的影响[J].中国美容医学,2011,20(6):944-946.
[2]Scott G. Rac and Rho: The story behind melanocyte dendrite formation[J]. Pigment Cell Res, 2002, 15(5):322-330.
[3]Dormond O,Foletti A,Paroz C, et al. NSAIDs inhibit alpha beta 3 integrin-mediated and Cdc4/Rac-dependent endothelial cell spreading, migration and angiogenesis[J]. Nat Med,2001,7(9):1041-1047.
[4]廖非,刘栋.黑素小体转运机制的研究进展[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2009，8(2):125-127.
[5]Ito Y,Kanamaru A,Tada A.Centaureidin promotes dendrite retraction of melanocytes by activating Rho[J].Biochim Biophys Acta,2006,1760(3):487-494.
[6 ]Etienne,Manneville S,Hall A.Rho GTPases in cell biology[J].Nature,2002, 420(12):629-635．
[7]高润霖. 进一步加强阿司匹林在心脑血管疾病一级预防中的应用[J].医学研究杂志, 2008, 37(2):1-2.
[8]Mizokami Y.Efficacy and safety of rabeprazole in non-steroidal anti-inflammatory drug-induced ulcer in Japan[J]．World J Gastroenterol,2009,15(40):5097-50102.
[9]Lee JL,Kim A,Kopelovich L,et al.Differential expression of E prostanoid receptors in murine and human non-melanoma skin cancer[J].J Invest Dermatol,2005,125:8l8-825.
[收稿日期]2011-11-17 [修回日期]2012-01-28
编辑/张惠娟