摘要：以补阳还五汤HPLC指纹图谱为模型,来阐明指纹图谱总量统计矩分析法参数的计算及积分条件的确定。 关键词：总量统计矩分析法；补阳还五汤； HPLC指纹图谱
中图分类号：R2-03文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0505-04
Study on Calculation of Fingerprint Total Quantum Statistical Moment(TQSM) and
to Decide Integral Condition
ZHOU Jin1，DENG Kai?wen2，DUAN Xiao?peng1，HE Fu?yuan1
(1.College of Pharmacy, Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410208, Hunan, China；
2.省略。Abstract:To explain calculation of fingerprint total quantum statistical moment(TQSM) and to decide integral condition with HPLC fingerprint of the BYHW recipe as model drugs.
Key words:total quantum statistical moment(TQSM)；BYHW recipe；HPLC fingerprint
指纹图谱总量统计矩分析法［1］，是以总量统计矩分析方法为纲，以相似度分析为目的，指纹图谱的一种定性、定量研究新方法。该法据统计学中多维随机向量（连续型）求数学期望及方差的思路来找到多成分表达中心，同时还要分析这群成分离中心距离的偏差，即方差。包括四个参数 ①总量零阶矩AUCT；②总量响应率AUCPWT；③总量一阶矩MCRTT，亦总量中心矩或总量平均保留时间，用λT 表示,为各单个成分中心矩或保留时间λj与响应系数kr,j和构成比kc,j的算术平均值；④总量二阶矩VCRTT，亦为平均保留时间方差，用σ2T表示，亦为各单个成分方差σ2j与保留时间λj、总量中心矩λT、响应系数kr,j和构成比kc,j构成函数多项式，总标准差σT为总方差的平方根。在目前缺少中药复方药物多成分信息处理软件的情况下，本文所有数据采用EXCEL软件自编公式进行计算，不失为行之有效的方法，保证了本文计算结果的可靠性。同时指纹图谱分析积分条件确定的现状是无标准、无说明，积分条件的不同，对结果的影响较大。本文将以补阳还五汤HPLC指纹图谱为模型,阐明指纹图谱总量统计矩分析法参数的计算及积分条件的确定，旨在为同行作一参考。
1基本原理
1.1总量统计矩法的建立［2-3］
指纹图谱曲线的总量零阶矩、总量响应率、总量一阶矩、总量二阶矩按下式计算。
1.1.1总量零阶矩AUCT（area under curve of total quantum）与总响应率AUCPWT（area under curve of total quantum）AUCT为一定总量下曲线的总响应面积。用式（1-1）表示：
AUCT=Mi=1=∫λ0∑mj=1cTkr,jκc,j2πσj,i=1e-(λ－λj,i=1)2`2σ2j,i=1dλ
=CT∑mj=1kr,jκc,j0 由统计矩原理可知：总量统计矩可用单个成分统计矩表示；两两总量统计矩之和亦可用总量统计矩表示。这一性质可用来消除溶剂对中药复方成方指纹图谱的干扰，最终可得在一定色谱条件下的纯中药复方成分指纹图谱总量统计矩参数。
已知包括溶剂的指纹图谱总量统计矩参数的λT,i=1、σ2T,i=1及纯溶剂的总量统计矩参数λT,s,i=1、σ2T,s,i=1，可由式（5）求得扣除溶剂后中药复方指纹图谱纯成分的总量参数λT,p,i=1，式（6）求得σ2T,p,i=1。
λT,p,i=1=λT,i=1∑kr,jkc,j－λT,s,i=1∑kr，j,skc,j,s∑kr,j,pkc,j,p（5）
σ2T,p,i=1=
∑kr,jkc,j(σ2T,i=1+λ2T,i=1)-∑kr,jkc,j,s(σ2s,i=1+λ2s,i=1)∑kr，j,pkc,j,p
- λ2T,p,i=1（6）
2材料与方法
2.1仪器与试药
Waters公司的高效液相色谱仪，Breeze工作站，Waters 2487 Dual Absorbance Detector。黄芪、当归、川芎、赤芍、桃仁、红花、地龙对照药材均购于国家药品生物制品检定所，乙腈、甲醇为色谱纯，蒸馏水为二次重蒸馏水，乙醇等其它试剂均为分析纯。其复方药材来源：黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.Var. mongholicus (Bge.) Hsiao 干燥根；当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.) Diels的干燥根；川芎为伞形科植物川芎Iigusticum chuanxiong Hort的干燥根；赤芍为毛莨科植物芍药Paeonia lactlora Pall的干燥根茎；桃仁为蔷薇科植物桃Prunus persica （Linn） Batsch的干燥成熟种子；红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花；地龙为环节动物门钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum （perrier）的干燥主体。处方：黄芪60g 当归9g 川芎6g 赤芍9g 桃仁9g 红花9g 地龙9g。
鉴定方法：按《中国药典》2010年版一部有关项下进行鉴别，由本院中药鉴定教研室老师负责进行。
采购渠道：以上各药材均委托本校第附一附属医院药剂科定点采购。
2.2HPLC指纹图谱的方法建立
测定条件：C18柱(250 mm ×416 mm ID, 5μm) ,流动相: 乙腈:水(含1%乙酸)梯度洗脱: 0 min (0∶100)→10 min (0∶100) →25 min (7∶93) →35 min ( 12.5∶87.5) →45 min (18∶82) →55 min (25∶75) →65 min(30∶70) →70 min ( 32.5∶67.5)→71 min (37∶63) →80 min (40∶60) →100min (80∶20) →115 min (100∶0) →120min (0∶100) ；流速：1mL?min-1；UV 检测: 264 nm，温度: 40 ℃。
2.3供试品液的制备
①补阳还五汤对照药材处方液的制备:按处方比例精密称定全方11.19g，用8倍蒸馏水回流提取1h，过滤，蒸发浓缩水液至10.0mL，加8倍量乙醇醇沉，再滤过,浓缩，用甲醇定量至10.0mL，得补阳还五汤对照药材处方溶液。②补阳还五汤样品处方液的制备:按处方比例精密称定全方，用8倍蒸馏水回流提取1h，过滤，蒸发浓缩水液至111mL，8倍量乙醇醇沉，再滤过，浓缩，用乙醇定量至100.0mL，得补阳还五汤样品处方溶液。图1甲醇HPLC图2补阳还五汤对照药材处方液HPLC3参数的计算
数据先由理论塔板数（Plate Count）与保留时间（λj，i=1）计算出各峰的方差，空格峰的理论塔板数以临近的较小保留时间峰计。再按式(3)、(4)，用Excel文件中的数学计算公式：如求和（SUM）、次幂（POWDER）、两两数据组乘积和（SUMPRODUCT）、两两数相乘积（PRODUCT）等，可以得到总零阶矩AUCT；总响应率AUCPWT；总量一阶矩MCRTT，亦总量中心矩或总量平均保留时间λT,i=n；总量二阶矩VCRTT，亦为平均保留时间方差σ2T，i=n（表1）。
由统计矩原理可知：总量统计矩可用单个成分统计矩表示，两两总量统计矩之和亦可用总量统计矩表示。这一性质可用来消除溶剂对中药复方成方指纹图谱的干扰，最终可得在一定色谱条件下的纯中药复方成分指纹图谱总量统计矩参数。已知包括溶剂的指纹图谱总量统计矩参数的λT,i=1、σ2T,i=1及纯溶剂的总量统计矩参数λT,s,i=1、σ2T,s,i=1，可由式（5）求得扣除溶剂后中药复方指纹图谱纯成分的总量参数λT,p,i=1，式（6）求得σ2T,p,i=1。因而可以计算出补阳还五汤对照药材处方液扣除溶剂后复方指纹图谱纯成分的总量统计矩参数（表2）。表2补阳还五汤对照药材处方液纯成分参数
参数补阳还五汤对照药材处方液20μL20μL20μL20μL20μL20μL 甲醇BYHW-甲醇最大峰面积(μv?sec)1.530×1071.657×1078.550×1067.819×1061.013×1074.523×105最小峰面积(μv?sec)9.037×1038.468×1031.081×1041.173×1041.337×1047.544×103∑λj (min)7.185×1036.411×1036.771×1036.481×1036.166×1036.782×103AUCT（∑Aj,μv?sec）9.659×1071.321×1086.123×1073.259×1075.075×1074.199×1067.045×107AUCPWT（μv?sec?mg -1）1.197×1061.236×1061.123×1069.769×1051.085×1062.658×1058.578×105∑λj?Aj（μv?sec?min）3.793×1095.040×1092.433×1091.224×1091.780×1092.766×1082.577×109∑σj2?Aj（μv?sec?min2）4.920×1065.670×1062.832×1062.417×1071.878×1061.465×1057.748×106∑λj2?Aj（μv?sec?min2）2.440×10113.134×10111.552×10118.578×10101.179×10112.506×10101.582×1011λT,i=1(min)39.2738.1739.7437.5535.0765.8836.58σ2T,i=1 (min2)984.2916.2956.2122310931627907.6通过上述补阳还五汤指纹图谱总量统计矩的参数研究，说明总量统计矩与一般的多成分分析方法相比，具有强大的整体的刻画能力和加合作用。不仅能用于中药复方指纹图谱分析，还能用于消除试剂干扰，整合不同参数，得到扣除溶剂后中药复方指纹图谱纯成分的总量参数，从而构建适宜中药复方多成分的指纹图谱总量统计矩分析方法。
4积分条件的确定
精密吸取甲醇液20μL，进样测得指纹图谱，分别以峰宽、响应率、最小峰面积、最小峰高分别为0.01s；、0μVs-1、0μVs、0μV的仪器最低值积分得空白甲醇的参数。由于在进行梯度洗脱时，因洗脱剂的比例改变及甲醇的杂质所产生稳定的空白对照峰，分别再按峰宽、响应率、最小峰面积、最小峰高分别为0.01s；、0μVs-1、3000μVs、0μV积分，得空白参数。将空白的峰当作色谱峰处理，总峰数减去空白色谱峰，根据噪音峰的平均峰宽、平均响应率、平均最小峰面积、平均最小峰高以及信噪比为3倍［4］确定该指纹图谱的积分阈值：峰宽、响应率、最小峰面积、最小峰高分别为26s、30μVs-1、8600μVs、500μV。数据的概况列于（表3）。
表3补阳还五汤指纹图谱积分条件的确定
参数甲醇（20μL）0.01：0：
0：0*0.01：0：
3000：0*积分条件峰数63224608∑λj (min)3.740×1041.280×10359.40AUCT(μv?s)3.151×1061.410×1062.862×103∑hj(μv)1.921×1059.110×104166.1峰宽：4 σi（s）26响应率(μV?s-1)30最小峰面积(μV?s)8.60×103最小峰高(μV)500吸取补阳还五汤样品提取液20μL进样测定，分别按峰宽、响应率、最小面积、最小峰高为7.5s、25μV?s-1、2000μV?s、85μV；15s、50μV?s-1、4000μV?s、170μV；25s、75μV?s-1、6000μV?s、250μV；30s、100μV?s-1、8000μV?s、340μV 4种不同积分条件积分得各指纹图谱参数列于表4。
275.0321.2286.7306.66.912由表4可知对同一样品指纹图谱的不同条件下积分，峰数RSD为55.91%，最大峰面积的RSD为10.09%，最小峰面积的RSD为104.7%，λT?ii=1的RSD为2.670%，σ2T,i=1的RSD为6.912%，说明不同积条件对峰数目、大小峰面积影响很大，而对λT,i=1、σ2T,i=1影响不大。说明运用中药复方多成分的指纹图谱总量统计矩分析方法，其参数结果抗干扰性强，能准确反映中药复方多成分体系的指纹图谱特征
5结语
由理论和上述实验可知,总量统计矩法是建立在对指纹图谱函数曲线分析的基础上,不按峰峰相应的分析思路来分析指纹图谱的特征，其运算参数具有统计学性质，各参数可以进行加合处理，从而达到动态消除成分干扰的作用，其参数结果抗干扰性强，能快速、动态、准确反映中药复方多成分体系的指纹图谱特征。
参考文献
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