摘要：目的：建立HPLC法测定红花微乳中羟基红花黄色素A的含量。方法：采用色谱柱：Diamonsil C18(2)5μm，250mm×4.6mm；流动相：甲醇-0.4%的磷酸水溶液（三乙胺调至pH=3.3）为30∶70；检测波长：402nm；柱温：室温。结果：羟基红花黄色素A在0.3128～3.128μg的范围内呈良好的线性关系(r=0.9990)。结论：本测定方法快捷，简便，准确，重现性好。
关键词：HPLC；红花微乳；羟基红花黄色素A
中图分类号：R284.1文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0495-02
Determination of Carthamus Tinctorious-containing Microemulsion by HPLC
JI Xin?yan1,2，LIU Ya?ming2，FENG Qian?jin2，ZHAO Jun?yun1，CHANG Rui?hua2，FENG Wen?quan2，LIANG Hong?juan2
(1.Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；
2.Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030024，Shanxi，China)
Abstract:Objective：To establish a method for the determination of hydroxyl safflor yellow A(HSYA) in Carthamus tinctorious-containing microemulsion．Method：The HPLC was used with Diamonsil C18(2) column(50mm×4.6mm，5μm),detection wavelength at 402nm, mobile phase methanol-water(pH3.3) 30∶70, flow rate:0.8mL/min. Results：HSYA has good linear relationship between 0.3128～3.128μg, r=0.9990,the recovery of HSYA was 99.93% and RSD was 1.86%(n=6). Conclusion：The method is simple, sensitive and reliable to carry out to control the assay of Carthamus tinctorious-containing microemulsion transdermal delivery system.
Key words:HPLC；Carthamus tinctorious-containing microemulsion；hydroxyl safflor yellow A
收稿日期：2011-10-27
基金项目：国家科技攻关计划资助项目（2004BA721A46）；山西省科技厅资助项目（2011091014）
作者简介：季新燕（1977-），女，山西长治人，博士研究生，研究方向：中西医结合基础。
通讯作者：刘亚明（1957-），男，山西临县人，教授，博士研究生导师，研究方向：中药方剂学与中药制剂新技术。红花为菊科植物红花(Carthamus tinctorious L．)的干燥花，为中药活血化瘀药，常用于治疗跌打扭伤、活血止痛，主要药效成分羟基红花黄色素(hydroxyl safflor yellow A，HSYA )具有抗炎镇痛的作用，能增大毛细血管的直径和开放数[1]。有临床实践报道，红花利多卡因醇、红花冰片等均有较好的抗炎镇痛作用[2-3]，目前尚无成熟制剂上市，且使用样品量不确切，临床应用推广不方便等，本实验室以微乳为药物载体，将其制备成外用制剂，为更好地研究红花微乳透皮和质量的控制, 建立了高效液相色谱法（HPLC）监控主要药理活性成分羟基红花黄色素A的含量,本方法简单易行,重复性好,准确可靠。
1仪器与药品
戴安summitP680高效液相色谱仪,summitP680A低压四元泵,PDA-100二极管阵列检测器，ASI-100自动进样器,summit柱温箱，Chromeleon色谱工作站；紫外扫描分光光度计（Cary 50，Varian）。
羟基红花黄色素A标准品溶液（浓度为0.1564mg/mL,山西太原华卫药业提供），甲醇，磷酸为色谱纯;水为超纯水;其余为分析纯，红花水提液（山西太原华卫药业提供），红花微乳（实验室自制，批号分别为：101220,110320,110504）。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱：Diamonsil钻石C18(2)5μm，250mm×4.6 mm；流动相：甲醇-0.4%的磷酸水溶液（三乙胺调至pH=3.30）为30∶70；检测波长：402nm；柱温：室温。流速0.8mL/min。在此色谱条件下，羟基红花黄色素A的保留时间约6.9min。
2.2对照品溶液制备精密称取羟基红花黄色素A对照品适量，用25%甲醇制成0.0156mg/mL的对照品溶液。
2.3供试品溶液制备精密吸取复方红花微乳1.0mL，用25%甲醇定容于10mL容量瓶中，摇匀，用0.45μm滤膜滤过作为样品溶液。
2.4线性考察精密称取105℃干燥至恒重的羟基红花黄色素A对照品，加25%甲醇制备得质量浓度为0.1564mg/mL贮备液，分别取2、5、10、15、20μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定羟基红花黄色素A的峰面积。以羟基红花黄色素A对照品进样量X(ug)为横坐标，以羟基红花黄色素A的峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程：Y=3×106 X +316152,r=0.9990（n=5）；结果表明：羟基红花黄色素A在0.3128～3.128μg质量范围内线性关系良好。
2.5阴性对照试验精密吸取取不含红花水提液的空白微乳0.1mL，依照2.3项下操作，结果显示空白微乳对羟基红花黄色素A的测定不产生干扰，说明复方红花微乳的辅料不影响测定，结果见图1。
2.6精密度试验吸取2.2项下对照品溶液，依法测定，记录连续6次的峰面积，并计算其RSD为1.89%，表明精密度良好。
2.7稳定性试验取2.2项下对照品溶液，每隔2h进样1次，每次10μL，考察峰面积的变化，试验表明在8h内稳定性良好，RSD为1.63%。
2.8重复性试验取同一批号（110504）的红花微乳原液自制样品5份，精密吸取1mL，用甲醇定容至10mL，依法测定，每次10μL，计算得平均含量，RSD为2.03%。
2.9加样回收率取同一批号（110504）含羟基红花黄色素A复方红花微乳样品溶液，精密吸取复方红花微乳0.5mL，于10mL容量瓶中，同时精密加入一定浓度的对照品（0.1564mg/mL）溶液各0.5mL，然后用甲醇定容至10mL，精密吸取该样品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，依法测定计算结果见表1。
表1加样回收率测定结果（n=6）
样品量
(mg)加入量
(mg)测得量
(mg)回收率
(%)平均回收率
(%)RSD
(%)0.06150.07820.1366597.820.06150.07820.1391599.610.06150.07820.135997.280.06150.07820.1405100.570.06150.07820.139699.930.06150.07820.1378598.6898.981.292.10样品的测定取3个不同批号的红花微乳原液自制样品1mL，用甲醇定容至10mL，取羟基红花黄色素A对照品溶液（0.1564mg/mL），分别进样10μL，依法测定，得到羟基红花黄色素A对照品溶液峰面积积分值，用外标法计算3批红花微乳样品中羟基红花黄色素A的含量，结果见表2。
表23批样品含量测定结果（n=3）
样品批号HYSAmg/mLRSD%1105020.10571105030.131.141105040.123ABC
A -HYSA对照品B样品C空白微乳（阴性）
图1羟基红花黄色素A(HYSA)的HPLC图3讨论
近年来对红花提取物及羟基红花黄色素A的高效液相色谱法分析方法的报道不少[4-8]，总起来有约17种，但是存在着磷酸或冰醋酸的量较多，流动相酸度较高，对于分离的色谱柱来说，填料容易变脆,易于溶解,柱压也会逐渐升高,色谱柱的寿命缩短；或者有些柱效低、分离度差、峰拖尾严重不适于含量测定如甲醇-0.4%磷酸水溶液等。在本实验中，用三乙胺调节流动相pH值后，分离效果增强，出峰时间缩短，在线性范围内，羟基红花黄色素A的峰型良好，没有拖尾现象，适用于红花微乳的含量测定。
参考文献
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