【摘要】 目的 观察?丙酯对四氯化碳导致的肝纤维化大鼠的保护作用,为临床治疗肝纤维化提供实验依据。方法 以四氯化碳皮下注射复制大鼠肝纤维化模型，设立正常对照组、肝纤维化模型组和?丙酯组，?丙酯组在造模的同时给予?丙酯注射液皮下注射。6周后取肝组织常规HE染色观察肝脏病变，天狼猩红胶原染色、肝组织羟脯氨酸(HYP)含量测定观察肝纤维化程度；赖氏法测定血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)；TBA 法检测肝组织丙二醛(MDA)水平，产色基质偶氮法鲎试剂定量测定血浆内毒素。结果 ?丙酯与肝纤维化模型组比较，①肝脏的损伤性改变较轻，肝组织HYP 及肝纤维化指数(FI)明显降低。②血浆内毒素含量、ALT 及肝组织MDA 均有不同程度的降低。结论 ?丙酯具有一定的抗肝纤维化的作用。?
【关键词】 内毒素；肝纤维化；?丙酯
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Preventive effect of Propylgallate on experimental hepatic fibrosis in rats
WANG Li?ping， XU Jun?quan， SONG Bin?Yu, et al.Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
【Abstract】 Objective
To explore the effects of propylgallate on hepatic fibrosis in rats. Methods Hepatic fibrosis in rats was induced by carbon tetrachloride, 24 rats were randomly divided into normal control group, hepatic fibrosis group and propylgallate group, propylgallate group rats were given propylgallate subcutaneously while inducing hepatic fibrosis by carbon tetrachloride. Rats were killed for collecting blood and liver tissues in 6 weeks. The pathological changes were observed by hematoxylin?eosin staining, the degree of liver fibrosis was observed by stained of Sirius red for collagen and the contents of hydroxyproline in liver tissues. Plasma alanine aminotransferase (ALT) was determined with Reitman?Frankel method; the content of malondialdehyde (MDA) in liver tissue was determined with TBA method. Endotoxin in blood plasma was measured with a limulus amebocyte lysate test kit. Results Propylgallate group compared with the hepatic fibrosis model group: ① fibrotic changes in liver were ameliorated, hydroxyproline in liver tissue and hepatic fibrosis index were significantly reduced. ② Plasma endotoxin, ALT and liver MDA were reduced as well. Conclusion Propylgallate has significant protective effect on liver fibrosis in rats induced by carbon tetrachloride.?
【Key words】 Endotoxin; Hepatic fibrosis; Propylgallate
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赤芍为毛莨科植物芍药、草芍药及川赤芍的干燥根，味苦性微寒，入肝经。研究显示赤芍具有广泛药理作用，如抗炎、护肝及抗氧化作用［1］。?丙酯系由中药赤芍的活性成分没食子酸经酯化反应成没食子酸丙酯，为全新化学合成药物，具有更强的生物效应，有抗血小板聚集、抗炎、抗自由基、扩张血管和改变血流流变、改善微循环等作用，临床上多用来预防与治疗脑血栓、冠心病及外科手术后的并发症?血栓性深静脉炎等。?丙酯的这些药理作用与肝纤维化的发病机理关系密切，但目前尚未见其抗肝纤维化作用的研究。本研究通过观察?丙酯对实验性肝纤维化形成过程及血浆内毒素的影响，探讨其防治肝纤维化的作用及可能的机制。?
1 材料与方法?
1.1 动物及试剂
健康清洁级雌性Wistar大鼠，体质量(230±20)g，购自山西医科大学实验动物中心；四氯化碳(CCl4)为中国中邦化工分析纯；产色基质偶氮法鲎试剂盒购自上海伊华医学科技公司，羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)标准品、天狼猩红、固绿FCF购自美国Sigma 公司；?丙酯注射液(北京四环制药有限公司)，丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒(北京北化康泰临床试剂有限公司)。?
1.2 方法 ?
1.2.1 动物分组及处理 将健康清洁Wistar 大鼠饲养1 周后随机分为3组，A 组(正常对照组)、B 组(肝纤维化模型组)、C 组(?丙酯处理组)。 A组不给予特殊处理，其他两组首次给予5 ml/kg体重CCl4?皮下注射，然后按3 ml/kg体重皮下注射40%CCl4?植物油(V/V)混合液，每周2 次，C 组于造模同时给予皮下注射?丙酯注射液［20 mg/(kg•d)］。 6 周后在乙醚麻醉无菌无热源条件下，腹主动脉采血，取血浆测定血浆内毒素水平及丙氨酸氨基转移酶(ALT)。取肝左叶一部分于4%多聚甲醛中固定，24 h内石蜡包埋，做肝脏的组织形态学检测，其余部分于?80℃保存备用。?
1.2.2 形态学检测 石蜡包埋组织切片，常规HE染色及天狼猩红胶原染色。运用形态学图像采集及分析系统(JD?801 江苏捷达)观察分析。每组织随机取15个视野，通过比较各组肝组织的FI(纤维化指数)值评价肝纤维化程度,FI=纤维染色区面积/整个视野面积 100%。?
1.2.3 肝组织HYP含量的测定 参照本实验室以往的方法［2］。?
1.2.4 肝组织MDA的TBA法测定和血浆内毒素及ALT的测定分别参照试剂盒说明书操作。?
1.3 统计学方法 数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 17.0 软件进行分析，行单因素方差分析(One?way ANOVA)，SNK(q 检验)进行两两比较，P 2 结果?
2.1 一般情况
正常对照组大鼠健康状况良好，肝脏光滑红润；肝纤维化模型组大鼠的活动及摄食减少，体重下降，肝脏表面粗糙成沙粒状，?丙酯组改变较模型组轻，体重下降较慢。?
2.2 形态学观查
正常对照组肝组织结构清晰，肝小叶结构正常，胶原少；肝纤维化模型组肝细胞变性，排列杂乱不规则，肝窦及汇管区结构破坏，胶原组织明显增多；?丙酯处理组肝细胞变性较模型组轻，胶原形成较模型组少，主要分布在血管区(图1)。?
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图1
各组肝组织胶原染色检测结果?(A为正常对照组，B为模型组,C为?丙酯处理组， 4)
2.3 ?丙酯对大鼠血浆内毒素，ALT，肝脏组织HYP,MDA和肝纤维化指数的影响。?
?丙酯处理组与模型组相比血浆内毒素，ALT，肝组织HYP，MDA和肝纤维化指数均降低，结果见表1。?
表1
各组大鼠血浆ET、 ALT及 肝组织MDA、 Hyp 、FI的变化(x±s)
组别例数ET(Eu/ml)HYP(mg/g)FI(%)ALT(U/L)MDA(nmol/mg)
正常对照组80.08±0.030.26±.0.070.37±0.0844.45±4.970.16±0.01
肝纤维化模型组80.57±0.04??a?0.57±0.07??a?5.15±0.56??a?154.72±4.97??a?1.44±0.02??a?
?丙酯处理组80.47±0.08??ab?0.44±0.05??ab?4.20±0.44??ab?125.20±4.13??ab?1.10±0.02??ab?
注：与正常对照组比较，??a?P［3，4］。同时肠源性内毒素血症与肝纤维化的发生发展也有着密切关系，多种肝病均伴有肠源性内毒素血症［5，6］。内毒素可直接或间接刺激肝星状细胞激活并增殖，促进细胞外基质合成，进而发展为肝纤维化。?
虽然提高抗纤维化的疗效和寻找有效的抗肝纤维化药物是当前的研究热点之一。但目前临床上尚无高效且无明显毒副作用的西药。而中药药物治疗越来越显示出独特优势，许多复方试剂和中药单体提取物在实验和临床研究中显示了良好的应用前景。比较有效的有黄芪、赤芍、丹参、当归、柴胡、桃仁、冬虫夏草、甘草甜素、姜黄素、大黄素、银杏叶提取物等。其抗纤维化机制主要有抑制肝炎病毒的复制，清除自由基，抑制HSC的活化和增殖，抑制ECM合成促进ECM降解，阻断TGF信号转导途径，调控基因表达水平促进胶原降解等［7］。研究表明， 赤芍具有清除自由基和抗脂质氧化作用，对肝细胞的免疫损伤也有一定的保护,可促进肝细胞再生［8,10］, 魏利召等［11］研究也显示赤芍具有抗内毒素的作用。?
本实验用中药赤芍的活性成分没食子酸经酯化反应而成的?丙酯干预CCl4?诱发的肝纤维化大鼠，通过组织学观察，胶原染色，肝组织羟脯氨酸测定判定其对纤维化的作用，通过测定血浆内毒素含量，肝组织丙二醛(MDA)水平推测其抗纤维化作用的可能机制。结果显示?丙酯可以明显减轻肝脏纤维化程度，其机制与降低循环血液内毒素水平和肝脏脂质过氧化反应有关。?
参考文献?
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