“血红蛋白的提取和分离”是选修Ⅰ模块《生物技术实践》中的实验内容，其目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、方法和过程。本节内容主要是能理解凝胶色谱法、电泳法的基本原理，了解缓冲液的组成及其作用；掌握血红蛋白的提取与分离的基本过程和方法，并结合实验操作过程，分析实验和实验的注意事项。
■ 一、 实验原理及分析
提取和分离蛋白质的原理：利用蛋白质的各种理化特性（如形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等）的差异，由此提取和分离各种蛋白质。
1. 凝胶色谱法（分配色谱法）
（1） 原理：根据相对分子量的大小分离蛋白质的一种有效方法（分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢）。
（2） 凝胶材料：大多数是由多糖化合物（如葡聚糖、琼脂糖等）构成的微小多孔球体，如下图所示。
（3） 作用：分离蛋白质，测定生物大分子分子量等。
2. 缓冲溶液
（1） 原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节缓冲剂的比例可以制成在不同pH范围内使用的缓冲液。
（2） 缓冲液作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，保持溶液的pH基本不变。
3. 凝胶电泳
（1） 原理：在电泳过程中，决定带电分子迁移方向的是带电分子带电性质的差异，决定带电分子迁移快慢的是带电分子形状、大小和电量的不同。
（2） 分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
（3） 分离过程：在一定的pH下，许多生物大分子上可解离的基团就会带上正电或负电。加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
4. 实验操作
（1） 样品处理：
① 红细胞的洗涤。
洗涤的目的是除去血浆中的杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。为防止血液凝固，应预先加入柠檬酸钠；采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯。
所用洗涤液是五倍于红细胞液的生理盐水；洗涤中用玻璃棒缓慢搅拌，用离心机低速短时离心；洗涤干净的标准是上清液没有黄色。
② 血红蛋白的释放。
释放的目的是将血红蛋白从红细胞中释放出来。在红细胞液中加入等体积的蒸馏水和40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌。红细胞破裂释放出血红蛋白。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。
（2） 粗分离：
① 分离血红蛋白溶液。
目的是从红细胞破碎混合液中分离出血红蛋白溶液。将红细胞破碎混合液进行高速离心处理后，离心管中的溶液分为4层。从上到下依次是：无色透明的甲苯层、白色固体的脂溶性沉淀层、红色透明的血红蛋白溶液层和暗红色的破碎物沉淀层。用滤纸过滤以除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置后分离出血红蛋白溶液。
② 透析。
目的是除去血红蛋白溶液中的无机盐离子和有机小分子等分子量较小的杂质。将血红蛋白溶液装入透析袋中，放入磷酸缓冲液中透析12 h。
5. 凝胶色谱操作（分离纯化）
① 凝胶色谱柱的制作。
② 凝胶色谱柱的装填：
实验所用凝胶是交联葡聚糖凝胶（G－75），其中G表示交联程度、膨胀程度和分离范围；75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5 g。
将凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内，使凝胶装填均匀并不能有气泡存在。然后用磷酸缓冲液充分洗涤平衡12 h，使凝胶装填紧密。
③ 样品的加入和洗脱：
调节缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
加入蛋白质样品：用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱的顶端。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入凝胶层后，关闭出口。
调节缓冲液面：加入20 mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度。
洗脱：连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。
收集分装蛋白质：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集。
④ 纯度鉴定――SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
■ 二、 解题指导及思路点拨
1. 题型探究：凝胶色谱法分离蛋白质
考生特别要注意对缓冲溶液的组成、作用机理、配制方法等方面的理解。
■ 例1 凝胶色谱法分离蛋白质的原理是（ ）
A. 根据蛋白质分子的形状
B. 根据蛋白质相对分子质量的大小
C. 根据蛋白质所带电荷的多少
D. 根据蛋白质溶解度的大小
■ 思路点拨 凝胶色谱法所用的凝胶是一种微小的多孔球体，在小球内部有许多贯穿的通道，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长。移动速度较慢，相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
■ 答案 B
■ 例2 将经处理破裂后的红细胞混合液以2 000 r/min的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是（ ）
A. 血红蛋白、甲苯层、脂类物质层、沉淀层
B. 甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂类物质层
C. 脂类物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层
D. 甲苯层、脂类物质层、血红蛋白、沉淀层
思路点拨 混合液经离心后，按密度大小排列，在离心管中从上到下的顺序依次是：第一层为无色透明的甲苯层；第二层为白色薄层固体，是脂溶性物质沉淀层；第三层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液；第四层为暗红色沉淀物，主要是红细胞破碎物沉淀。
■ 答案 D
■ 例3 凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很好的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且，已经大规模地用于工业生产。据右图回答问题：
（1） a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是_______________，原因是____________________________________。
（2） 自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由_______替代。
（3） 装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是_________。
（4） 洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体_________（填“相同”或“不同”），洗脱时，对洗脱液的流速要求是_________。
■ 思路点拨 用凝胶色谱技术分离各种大分子物质时，大分子物质先洗脱出来，然后是小分子物质。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所以向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔，即进入凝胶内，在向下移动的过程中，从一个凝胶颗粒内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质从而落后于大分子物质洗脱出来。在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙：一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果；二是凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。
■ 答案 （1） a a分子量大，不易进入凝胶颗粒的微孔而通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快
（2） 尼龙网和尼龙纱
（3） 气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
（4） 相同 保持稳定
2. 题型探究二、与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质分离的意义
哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
■ 例4 关于血红蛋白分子组成的叙述正确的是（ ）
A. 两个α-肽链、两个β-肽链、一个亚铁血红素基团
B. 一个α-肽链、三个β-肽链、四个亚铁血红素基团
C. 两个α-肽链、两个β-肽链、四个亚铁血红素基团
D. 两个α-肽链、两个β-肽链、两个亚铁血红素基团
■ 思路点拨 血红蛋白又称血色素，是红细胞的主要组成成分。血红蛋白由四个肽链组成，它包括2个α-肽链、2个β-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，因此共有四个亚铁血红素基团。
■ 答案 C
3. 题型探究三、探讨电泳的原理
电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。
■ 例5 蛋白质分子中，氨基酸的α-氨基和α-羧基虽然大部分结合成为肽键，但是蛋白质分子内仍含有各种酸性基团和碱性基团，如肽链末端的α-氨基和α-羧基、天冬氨酸和谷氨酸残基中的羧基、赖氨酸和组氨酸残基中的各种碱性基团，所以蛋白质是两性电解质。在酸性溶液中，碱性基团的解离增大，使蛋白质带正电荷；在碱性溶液中酸性基团的解离加强，使蛋白质带负电荷。当溶液到达某一pH时，蛋白质可因内部酸性和碱性基团的解离相等而呈等电状态，这时的溶液pH叫做蛋白质的等电点。不处于等电点状态的蛋白质分子的正、负电荷量是不相同的。试回答下列问题：
（1） 多数蛋白质的等电点近于5，一般含碱性基团较多的蛋白质的等电点_________（“偏高”还是“偏低”）。
（2） 根据等电点的不同，你能用_______方法将不同种类的蛋白质分子分开。
（3） 简述根据等电点分离不同种类的蛋白质分子的原理________________________
_____________________________________。
■ 思路点拨 含碱性基团较多的蛋白质溶液，在pH近于5时解离程度较大，蛋白质带正电荷。要使蛋白质内部酸性和碱性基团解离相等呈等电状态，必须提高溶液的pH，使酸性基团解离增加，故蛋白质的等电点提高。根据等电点不同，可以利用电泳法将特定的蛋白质分离出来。
■ 答案 （1） 偏高
（2） 电泳
（3） 不处于等电点状态的蛋白质分子的正、负电荷量是不相同，在电泳过程中，决定蛋白质迁移方向的是蛋白质带电性质的差异，决定蛋白质迁移快慢的是蛋白质分子形状、大小和电量的不同。
■ 巩固训练
1. 用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（ ）
A. 路程较长，移动速度较慢
B. 路程较长，移动速度较快
C. 路程较短，移动速度较慢
D. 路程较短，移动速度较快
2. 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是（ ）
A. 鸡的红细胞无血红蛋白，人的红细胞有血红蛋白
B. 鸡的红细胞有线粒体，人的红细胞无线粒体
C. 鸡的红细胞有细胞核，人的红细胞无细胞核
D. 鸡的红细胞进行有氧呼吸，人的红细胞进行无氧呼吸
3. 蛋白质提取和分离的步骤包括（ ）
A. 样品处理、凝胶色谱操作、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
B. 样品处理、凝胶色谱操作、纯化
C. 样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定
D. 样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定
4. 在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是（ ）
A. 防止血红蛋白被O2氧化
B. 血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和
C. 磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
D. 让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能
5. （多选）人体血液中的缓冲物质都是由一种弱酸和相应的强碱盐组成，下列缓冲对正确的是（ ）
A. Na2CO3/NaHCO3
B. Na3PO4/NaH2PO4
C. NaH2PO4/Na2HPO4
D. H2CO3/NaHCO3
6. 某同学在实验课前从学校附近的屠宰场取新鲜的猪血，并在采血容器中预先加入了抗凝血剂柠檬酸钠，取血回来马上进行实验，请回答有关红细胞洗涤的有关问题：
（1） 洗涤红细胞的目的是___________。
（2） 你如何知道红细胞已洗涤干净：__________________________________。
（3） 分离红细胞时的离心速度及离心时间分别是___________________________。
（4） 如若离心速度过高和时间过长，则结果会怎样___________________________。
7. 红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带O2或CO2，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：
（1） 实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。
① 加入柠檬酸钠的目的是__________。
② 以上所述的过程即样品处理，它包括________________、________________、收集血红蛋白溶液。
（2） 收集的血红蛋白溶液在透析袋中经过透析，这就是样品的粗分离。
① 透析的目的是_________________。
② 透析的原理是___________________
____________________________________。
（3） 通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
① 样品纯化的目的是_______________
_____________________________________。
② 血红蛋白的特点是_______________
_____________________________________。
这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义____________________________________
_____________________________________。
■ 答案
1. D
2. C
3. C
4. D
5. CD
6. （1） 去除血浆蛋白
（2） 离心后的上清液没有黄色
（3） 低速（如500 r/min）短时间（如2 min）
（4） 离心速度过高和时间过长会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度
7. （1） ① 防止血液的凝固
② 红细胞的洗涤 血红蛋白的释放
（2） ① 去除相对分子质量较小的杂质
② 透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内
（3） ① 通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去
② 血红蛋白呈现红色 在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作