摘要：目的：观察比较关木通及当归四逆汤各拆方组中马兜铃酸A的变化趋势，探讨中药配伍对马兜铃酸A含量的影响。方法：参照当归四逆汤原方比例将供试样品分6组:关木通组、全方组、关木通+补气补血组、关木通+散寒组、关木通+甘草组、阴性对照组(全方去关木通)；采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法，以甲醇―水―冰乙酸(体积比74∶24∶1)为流动相，以DiamonsilTM(钻石)C18(250 mm×4?6mm，5μm)为色谱柱，检测波长237 nm，测定各组中马兜铃酸A的含量。结果：与关木通组相比，当归四逆汤全方中马兜铃酸A含量最低；关木通+补血组马兜铃酸A含量也有明显降低。结论：在方剂配伍理论指导下，通过合理配伍降低关木通的毒性是可行的。
关键词：当归四逆汤；马兜铃酸A；中药配伍；色谱法，高压液相
中图分类号：R284.1文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0549-03
Effect of Chinese Herbal Medicine Compatibility on Aristolochic Acid
Content in Danggui Sini Decoction
RUAN Ye?ping，HU Xiu?min,ZHAO Yan?min
(Zhejiang University of TCM，Hangzhou 310053,Zhejiang,China)
Abstract:Objective:To compare aristolochic acid (AA) content in Caulis Aristolochiae Manshuriensis (CAM) and in the separated prescriptions of Danggui Sini Decoction (DSD)，and to explore the effect of Chinese herbal medicine compatibility on AA content.Methods:According to the herbs percentage compared to DSD,the herbs samples were named: CAM group,DSD group，CAM group with Qi?blood-nourishing herbs,CAM group with herbs for cold scattered,CAM group with Radix Glycyrrhizae，and DSD group with CAM removed. The AA content was determined by reverse phase HPLC. Gradient eluted with a mixture of methyl alcohol water and acetic acid (volume proportion as 74∶24∶1)，the chromatographic conditions were as follows: C18Diamonsiltm analytical column，and detection wavelength at 237nm.Results:AA content was the lowest in DSD group， and was lower in CAM group with yin-nourishing herbs than that in CAM group.Conclusion:Subjecting to the theory of Chinese herbal medicine compatibility，it is feasible to reduce the CAM toxicity by composing a prescription with proper proportion of herbs.
Key words:Dangui Sini Decoction；aristolochicacid；compatibility(TCD)；chromatography；high pressurie liquid
收稿日期：2011-10-26
基金项目：浙江省教育厅科研计划项目（Y200907246）
作者简介：阮叶萍（1976-），女，浙江渚暨人，副教授，硕士，研究方向：中药药理学的教学与科研。当归四逆汤源于东汉名医张仲景的《伤寒论》，由当归、桂枝、白芍、通草、甘草、细辛、大枣等药物组成。当归四逆汤通脉止血，温经养血，主治血虚寒凝，经脉不利之脉细欲厥、四肢厥寒等证，不仅在临床上得到广泛应用，后人根据病症在原方的基础上加减，或将其与其他方配合使用。方中应用痛草，即为关木通(Caulis Aristolochiae Manshuriensis，CAM)，系马兜铃植物东北马兜铃Aristolochiamanshruiensis Kom.的干燥藤茎，其主要化学成分为马兜铃酸A、B、D。关木通性苦寒且有毒，有清心火、通经下乳、利小便的功效，现代研究表明其药理作用有抗突变、抗肿瘤、利尿及降血压的作用[1]。关木通含有损害人体肾脏的马兜铃酸，2003年6月国家食品药品监督管理局发出通知取消了其药用标准，意味着关木通不能作为一种合法中药使用[2]。本文以当归四逆汤(Danggui SiniDecoction，DSD)为例，观察当归四逆汤及其拆方组对关木通中马兜铃酸A (adritolochic acid，AA)含量的影响，从而验证方剂配伍理论的合理性，探索中药配伍降低关木通毒性的规律性。
1仪器与试药
1.1仪器戴安Summit P680高效液相色谱仪(美国DIONEX公司)；UVD170U紫外检测器(美国DIONEX公司)。
1.2药品对照品马兜铃酸A由国家药品生物制品检验所提供(批号为: 110746-200406)；当归、桂枝、通草、关木通、白芍、细辛、甘草、大枣均购自杭州市第三人民医院中药房。
1.3试剂甲醇为色谱纯；冰醋酸、无水甲醇、盐酸、乙醚为分析纯，水为娃哈哈纯净水。
2方法与结果
2.1色谱条件检测波长: 237 nm；柱温:室温(25℃)；流动相: 甲醇-水-氯仿-三乙胺(100∶50∶3∶0.15)；流速1mL/min，进样量20μL。
色谱柱: DiamonsilTM(钻石) C18(250 mm×4?6mm，5μm)；检测器: UVD170U紫外检测器；
2.2样品的制备根据《古今名医方论》注:“阴血内虚，则不能荣于脉；阳气外虚，则不能温于四末，故手足厥寒、脉细欲绝也。故用当归为君，以补血；以芍药为臣，辅之以养营气；以桂枝、细辛散寒温气为佐；以大枣、甘草益其中，补其不足；以通草通行其脉道与厥也。”方中有当归12g，桂枝9g，白芍9g，细辛3g，关木通6g，大枣8枚，炙甘草6g，剂量按原方比例，分以下6组:关木通组:关木通6g；全方组:当归12g，桂枝9g，白芍9g，细辛3g，关木通6g，大枣8枚，炙甘草6g，关木通+补气补血组:关木通6g，当归12g，白芍9g；关木通+散寒组:关木通6g，桂枝9g，细辛3g；关木通+甘草组:关木通3g，生甘草6g；阴性对照组:当归12g，桂枝9g，芍药9g，细辛3g，大枣8枚，炙甘草6g。取供试样品，加水400mL，浸泡30min，煎煮60min，用纱布过滤。药渣再加水100mL，煎煮30min，纱布过滤。合并2次滤液浓缩至50mL，吸取10mL，用6mol/L盐酸调至pH=2，转移至分液漏斗中，用乙醚萃取4次 (10mL，5mL×3)；合并萃取液，水浴蒸干，用甲醇溶解，定容于10mL容量瓶中。通过0.45μm的微孔滤膜滤过，即得[3]。
2.3对照品溶液的制备称取马兜铃酸A对照品适量，放于10mL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，放置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成0.041mg/mL的溶液即得[4]。
2.4线性关系考察按照以上色谱条件测定，精密称取马兜铃酸A对照品溶液5、10、15、20、25μL，以峰面积为横坐标X，以进样量为纵坐标Y，绘制标准曲线，结果显示马兜铃酸线性范围为0.084～0.680μg，方程为Y=0.044 6X-0.017 3，R=0.9998，见图1。
2.5精密度试验将马兜铃酸A标准品溶液连续进样4次，测量得出马兜铃酸A峰面积sR为2.1%。
2.6稳定性试验将关木通样品在同样条件下，分别在0、1、2、4h进样4次，测量得出马兜铃酸A峰面积sR为2.2%。结果表明马兜铃酸A在4 h内稳定性良好[5]。
2.7加样回收率实验精密称取已知含量的样品5份，分别加入一定量的马兜铃酸A，按2.2所示方法操作与测定，并根据样品含量及马兜铃酸A对照品的加入量，计算回收率。结果显示平均回收率为99.3%。
2.8样品测定取各组样品溶液，于2.1色谱条件下进行测定。结果见表1、图2。
表1当归四逆汤及各拆方组中马兜铃酸A含量比较
组别nApeak meanω/(mg.g-1)关木通组37.42121.0056全方组32.43580.32145关木通+补气补血组34.32350.61532关木通+散寒组35.14890.69875关木通+甘草组39.21571.49752阴性对照组30.00000.0000图1马兜铃酸A标准品图
图2当归四逆汤各拆方组中马兜铃酸A含量HPLC检测图谱
收稿日期：2011-10-11
基金项目：浙江省中医药科技计划资助项目（2010ZB016）
作者简介：戴关海（1972-），男，浙江绍兴人，副研究员，硕士研究生，研究方向：中药药理。
通讯作者：杨锋（1955-），男，浙江诸暨人，研究员，硕士，研究方向：中药药理。表1结果显示，当归四逆汤拆方实验研究后，关木通中马兜铃酸A的含量比较如下:全方组