【摘要】 目的 探讨兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchvmal stem cells，BMSCs)移植到兔退变椎间盘后，观察退变椎间盘中相关细胞因子的变化。方法 采用体外细胞培养技术，将兔BMSCs自骨髓血中分离、纯化和培养，成功传代到P3代后植入兔退变椎间盘的模型中，分别于2、4、8、12周用荧光定量PCR法测定MMP，1、IL，1的变化，所得数据经SPSS 13统计学软件进行统计学处理。结果 在实验组MMP，1、IL，1的含量随着治疗时间的延长，其含量逐渐降低，与正常组，空白组，干预组在统计学显示差异有统计学意义(P［1］中细胞分离培养及传代方法进行。选用生长状况良好的第3代MSCs，传代培养于6孔板中行爬片，采用免疫化学ABC 法检测CD34、CD44、CD90 等抗原表达，并留取第3代BMSCs。?
1.2.2 退变椎间盘模型的建立
新西兰大白兔32只，1岁龄，2.5~3.5 kg，雌雄各半。麻醉方法同干细胞的提取。取右侧卧位，根据髂嵴定位(平腰6椎体常规备皮、消毒、铺巾。采用腰椎左侧前方倒“八”字人路，暴露脊柱的左前外侧。用21 g皮肤穿刺针头分别在L3~4、L4~5及L5~6椎间盘(兔的腰椎数为7节)进行穿刺。持针器夹持针头，尖端保留5 mm长度，于纤维环前外侧方平行终扳方向刺入，深度控制在5 mm，刺入后维持5 s，拔出穿刺针，遂层缝合创口，其中8只行手术但不行穿刺纤维环，作为正常组。术后将24只造模大白兔随机分空白组，干预组，实验组，每组8只，分笼饲养，术后3 d用庆大霉素肌肉注射。在第2周各组随机抽取2只行MRI。?
1.2.3 骨髓间充质干细胞的移植
造模成功后，实验组L3~4、L4~5、L5~6节段将用藻酸盐凝胶作为支架的BMSCs移植，干预组仅用藻酸盐凝胶干预，实验组和干预组分别按造模手术入路及方法移植BMSCs，空白组施行上述手术，但不行任何移植，正常组不施加任何处理。?
1.3 标本的处理及指标的检测?
1.3.1 标本的处理
移植术后分别在2、4、8、12周取材，每次每组各取2只，采用空气栓塞法处死动物。取各组实验大白兔L3~4、L4~5、L5~6阶段椎间盘，并用灭菌生理盐水清洗后液氮(，70℃)保存待用。?
1.3.2 荧光定量PCR反应检测IL，1、MMP，1的表达
采用标准Trizol一步法提取各标本中的椎间盘髓核细胞的总RNA，获得的RNA溶解保存于，80℃待用。取各样本1 μg稀释至500 μg，紫外吸收法测量RNA的含量和纯度(260和280 nm处吸收值，RNA溶液的A260/A280的比值为RNA浓度，比值范围1.8~2.1)。取2 μg 总RNA用逆转录酶MMLV进行样品cDNA合成，将逆转录产物cDNA 模板1 μl分别加入到总体积为50 μl的含有各种反应物的反应体系中，混合，离心，置于PCR仪内扩增。同时取等量cDNA 扩增β，actin 作为内参。PCR反应条件(共40个PCR循环数)：93℃ 2 min 预变性；然后93℃ 1 min、55℃ 1 min、72℃ 1 min；最后总延伸72 ℃ 7 min。PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶进行电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。紫外光凝胶成像系统扫描PCR产物条带灰度，以目的基因与β，actin 内参的灰度比值进行定量分。IL，1引物序列：上游引物5? GCCACAAAGCCAGAACAT 3?，下游引物5? TAACAGCGGAAGGCAAAT 3?,扩增长度为495 bp；MMP，1引物序列：上游引物 5? ATGAAGTTGCCCATAGAG 3?，下游引物5? GCCAAAGGAGCTGTGAAT 3?，扩增长度为113 bp；β，actin 引物序列：上游引物5? TCTCGACGAAACCTAACGG 3?，下游引物5? TCAAAGTCCTCGGCCACA 3?，扩增长度为207 bp。?
1.3.3 统计学方法
应用SPSS 13软件进行统计学描述与分析，所得数据用分析，进行方差分析，P 表1
表2
3 讨论?
BMSCs存在于骨髓中的非造血干细胞.由于其诸多优势使其可作为组织工程的种子细胞，如来源充足、有多向分化能力、生物活性强、体外分离培养操作简单、免疫原性低，移植引起的排斥反应相对较轻。诸多优势使BMSCs在椎间盘组织工程中成为研究的热点。Steck等［2］和Sakai等［3］对BMSCs修复椎间盘退变进行了动物体内外实验，均证实BMSCs具有活跃的增殖倍增能力，12周后实验组椎间盘高度，MRI信号强度有明显增高，蛋白多糖和2型胶原的含量实验组比模型组增高明显，从而延缓椎间盘退变。尽管如此，但BMSCs延缓椎间盘的作用机制，是BMSC向椎间盘分化还是影响退变椎间盘中IL，1、MMP，1等细胞因子的表达尚不明确。?
椎间盘退变主要表现在细胞和细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)成分的改变，在基质合成与降解失衡过程中，MMPs发挥着重要作用［4］。MMPs是结构中含有金属离子Zn??2+?的蛋白水解酶，可以降解除多糖外几乎所有ECM成分。MMP，1 是胶原酶亚家族中的一种，分布广泛，主要由成纤维细胞分泌，主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原［5］。目前已经明确，在椎间盘退变过程中，MMP，1的表达量明显增加，本实验中空白组和干预组与正常组方差分析，有统计学意义(P［6］，能刺激组织细胞产生前列腺E2(PGE2)，进而产生炎症［7］，不仅如此，它可能与胶原蛋白和蛋白多糖的讲解有关［8］。Elfervig等［9］和Le Maitre［8］等用IL，1分别在体内外刺激髓核细胞，均发现MMP，1、MMP，3表达增高，提示炎性因子可通过对MMPs表达的影响来介导椎间盘的退变。本实验中，通过上述两组实验实验数据的比较，线性分析发现IL，1、MMP，1之间均有显著的正相关关系。另外，经BMSCs治疗后，实验组中IL，1相比其他组别，IL，1有着明显的减少。说明BMSCs可能通过某些途径影响细胞炎症因子IL，1的表达，从而延缓椎间盘退变。?
参 考 文 献?
［1］ 张文，田杰，江德勤，等.骨髓MSC体外分化为心肌样细胞相关调控基因的时序表达. 中华心血管病杂志，2004，32(11):1004，100.?
［2］ Steck E， Bertmm H， Abel R， et al. Induction of intevertebral Disc，like cells from adult mesenchymal stem cells. Stem Cells，2005，23(3)：403，411.?
［3］ Sakai D， Mochida J， 1washina T， et al. Regenerative effects of Transplanting mesenchymal stem cells embedded in atelocol，lagen to the degenerated intervertebral disc. Biomaterials，2006,27(3)：335，345.?
［4］ Kozaci LD， Guner A， Oktay G， et al. Alterations in biochemical components of extracellular matrix in intervertebral disc herniation： role of MMP，2 and TIMP，2 in type II collagenloss. Cell Biochem Funct，2006，24(5)：431，436.?
［5］ Nagase H， Visse R， Murphy G. Structure and function of matrix met alloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research，2006，69：562，573.?
［6］ Le Maitre CL， Freemont AJ， Hoyland JA. The role of interleukin，1 in the pathogenesis of human intervertebral disc degeneration. Arthritis Res Ther，2005，7(4)：732，745.?
［7］ 卞翠荣，李德仁，周晓红，等.牙周炎与白细胞介素1 相关基因.中国公共卫生，2007，23 (9):1092.?
［8］ Le Maitre CL， Hoyland JA， Freemont AInterleukin，1 receptor antagonist delivered directly and by gene therapy inhibits matrix degradation in the intact degenerate human intervertebral disc： an in situzymographic and gene therapy study. Arthritis Res Ther，2007，9(4)：R83.?
［9］ Elfervig MK， Minchew JT， Francke E， et al. IL，1beta sensitizes intervertebral disc annulus cells to fluid，induced shear stress.J Cell Biochem，2001，82(2)：290，298.