[摘要] 目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）、生存素（Survivin）及抑癌基因P53在肝细胞癌（HCC）中的表达及意义。 方法 采用SP免疫组化方法检测58例HCC患者中HBx、Survivin及P53蛋白的表达，并分析其与临床病理特征的关系。 结果 HCC组织中HBx的表达率为46.6%（27/58）。HBx蛋白阳性的HCC组织和HBx蛋白阴性的HCC组织中Survivin、P53蛋白的阳性表达率分别为70.4%（19/27）、74.1%（20/27）和35.5%（11/31）、38.7%（12/31），组间比较差异均有统计学意义（均P ＜ 0.05）。HBx与Survivin、P53表达呈正相关（r = 0.413 6、0.432 2，P ＜ 0.05）。HBx染色的阳性率与AFP水平和分化程度相关；Survivin染色的阳性率与TNM分期和淋巴结转移相关；P53染色的阳性率与门静脉癌栓和肿瘤直径相关。 结论 在HCC的发生过程中HBx蛋白可上调Survivin及P53蛋白的表达，促进HCC的发生发展。
[关键词] 乙型肝炎病毒X蛋白；生存素；P53；肝细胞癌
[中图分类号] R575.2[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2012）03（a）-0030-03
越来越多的研究表明，乙型肝炎病毒（HBV）X基因及其编码的X蛋白（HBx）在乙型肝炎病毒相关肝癌发生起主要作用。P53突变存在于一半以上数量的人类肿瘤中，大约75%的肝细胞癌有P53突变。大部分肿瘤的发生都涉及凋亡障碍，Survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis protins，IAP）家族的成员，是迄今发现最强的凋亡抑制因子。本研究探讨三者在58例肝细胞癌中的表达及其与临床病理特征的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2000年2月～2010年5月廉江市人民医院手术切除并经病理组织学检查确诊为肝细胞癌（HCC）且有完整随访资料的标本58例，患者均未经过任何抗肿瘤治疗，HbsAg均为阳性。其中，男46例，女12例；年龄23～86岁，中位年龄60岁；AFP≥400 μg/L 47例，AFP＜400 μg/L 11例；肿瘤直径≥5 cm 39例，＜5 cm 19例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期12例，Ⅲ～Ⅳ期46例；组织分化程度：低中分化52例，高分化6例；伴有门静脉癌栓18例，腹腔淋巴结及远处转移9例。
1.2 试剂
HBx蛋白抗体和兔抗人Survivin mAb（1∶150），鼠抗人P53单克隆抗体及S-P试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 免疫组织化学染色
采用SP免疫组织化学法检测HBx、Survivin和P53蛋白的表达，按试剂盒说明书操作步骤严格进行操作。用已知阳性组织切片做阳性对照，以PBS液代替一抗作阴性对照。
1.4 结果判定标准
参照蒋成英等[1]的判断标准。阳性细胞计数：随机选择5个高倍视野，染色细胞＜5%计0分，5%～24%计1分，25%～49%计2分，50%～74%计分，≥75%计4分。染色强度：细胞不着色计0分；浅黄色计1分；棕黄色计2分；棕褐色计3分。染色强度得分与阳性细胞计数得分相乘，0分为阴性，1～4分为弱阳性（＋），5～8分为中度阳性（＋＋），9～12分为强阳性（＋＋＋）。
1.5 统计学方法
根据实验资料的性质，采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，相关分析采用Spearman等级相关系数，以P ＜ 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HCC中HBx、Survivin和P53的表达
HBx阳性表达则定位于细胞核（图1），Survivin阳性表达定位于细胞质（图2），P53主要表达在细胞核及核膜上（图3）。三者的阳性率分别为46.6%、51.7%和53.4%。HBx蛋白阳性的HCC组织和HBx蛋白阴性的HCC组织中Survivin、P53蛋白的阳性表达率分别为70.4%（19/27）、74.1%（20/27）和35.5%（11/31）、38.7%（12/31）。组间比较差异均有统计学意义（均P ＜ 0.05）。
2.2 HBx、Survivin、P53的表达与临床病理特征的关系
HBx染色的阳性率与AFP水平和分化程度相关，Survivin染色的阳性率与TNM分期和淋巴结转移相关，P53染色的阳性率与门静脉癌栓和肿瘤直径相关。见表1。
2.3 HBx与Survivin、P53的相关性
HBx蛋白阳性的HCC组织和HBx蛋白阴性的HCC组织中Survivin、P53蛋白的阳性表达率分别为70.4%（19/27）、74.1%（20/27）和35.5%（11/31）、38.7%（12/31），Spearman等级相关分析提示，HBx与Survivin、P53表达正相关（r = 0.413 6、 0.432 2，P ＜ 0.05）
3 讨论
人类、土拨鼠和地松鼠感染相应的哺乳动物正嗜肝DNA病毒后，X基因编码产生X蛋白，可发展为肝癌；而禽类感染嗜肝DNA病毒后，不能产生X蛋白，不发生肝癌[2]，所以认为X蛋白是引起HBV相关肝癌发生的关键因子。X蛋白的氨基酸序列与任何一种已知蛋白都不具有同源性，故名为X蛋白[3]。早期针对X蛋白诱发HCC的研究焦点在基因水平的变化，而目前研究发现X蛋白可以引起肿瘤抑制基因表观遗传学发生改变，X蛋白通过上调DNA甲基转移酶表达使肿瘤抑制基因的CpG岛异常甲基化，转录发生抑制，抑癌基因沉默，X蛋白这种功能相当于表观遗传学调节因子，在肝癌发生中起重要作用[4]。X蛋白是一种多功能调节因子，与其作用的蛋白几乎包括所有肿瘤相关蛋白，通过与宿主因素直接或间接作用参与下诉事件的调节：基因转录、信号转导、细胞周期进程、蛋白降解通路、凋亡和基因稳定性等。本研究提示HBx阳性表达与AFP水平及分化程度相关，表明HBx是肝细胞恶性化的始动因素。
P53是目前公认的与肿瘤发生发展相关性最高的抑癌基因之一。ASPP（P53凋亡刺激蛋白） 家族成员ASSP1和ASSP2可与P53特异性结合，促进P53与凋亡基因的启动子结合使其超活化，发挥其肿瘤抑制作用，HBx蛋白使ASSP2启动子甲基化使基因表达发生表观遗传学沉默，导致ASSP2及ASSP1表达下调，使P53的抑癌作用发生缺陷[5]。X蛋白对凋亡的影响是其致癌作用的主要机制之一，X蛋白对凋亡具有双重调节作用，主要是凋亡抑制。X蛋白诱发凋亡抑制的方式有多种途径，但最重要的功能是抑制P53介导的凋亡，X蛋白在细胞质内与P53形成复合物，阻止P53进入细胞核，阻断其转录控制和转录激活性能，同时干扰P53与其他凋亡通路上的蛋白因子相互作用[6]。本研究表明在HBx蛋白阳性的肝细胞癌中突变型P53表达明显升高，提示野生型P53功能被抑制，肝癌生长的动力学发生改变，肿瘤细胞倍增时间缩短，生长分数增加。本研究观察到的临床病理特征为突变型P53表达明显升高与肿瘤直径及门脉癌栓相关。
Survivin是一种在大多数人类肿瘤中过表达的凋亡抑制蛋白，过表达可以使有丝分裂畸变的细胞逃逸G2/M检测点（checkpoint），避免发生有丝分裂灾变形成异常分裂，最终形成癌变[7]。X蛋白使Survivin表达上调导致凋亡抵抗，新近发现的G2/M期相关基因HURP（hepatoma up-regulated protein），现有研究表明它具有癌基因特性，为Aurora-A癌基因的重要下游效应分子。由X蛋白诱发的Survivin上调是HURP依赖的。X蛋白激活HURP表达是通过丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPKs）信号通路实现的，最终形成Survivin积累，发生凋亡抑制[8]。Survivin染色的阳性率与TNM分期和淋巴结转移相关，表明Survivin主要在G2/M起作用，与肿瘤进展有关。
本研究结果HBV相关原发性肝细胞癌组织中HBx表达上调，HBx与P53、Survivin表达正相关，提示三者在肝癌发生发展的不同阶段起协同作用。
[参考文献]
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（收稿日期：2011-11-14本文编辑：张瑜杰）