摘要：目的：探讨原发性肝癌阳虚证患者血清代谢组模式改变特征，为实现肝癌阳虚证诊断的客观化、规范化提供依据。方法：应用肝癌基本证候定性诊断标准和量化分析模型判定原发性肝癌基本证候类别，将42例原发性肝癌患者分成阳虚证组21例，非阳虚证组21例作为对照病例。应用基于核磁共振波谱（NMR）技术的代谢组学研究方法获得血清1H NMR谱，用偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）等模式识别、多元统计分析方法，发掘不同基本证候样本代谢组变化模式，并对主要差异代谢物进行鉴定，分析其生物学意义。结果：利用1H NMR谱信息，用PLS-DA分析可以把阳虚证组和非阳虚证组代谢谱变化区分开，代谢物鉴定发现，肝癌阳虚证组和非阳虚证组有显著统计学意义(P Key words:primary liver cancer; metabonomics; Yang deficiency syndrome; nuclear magnetic resonance spectroscopy; serum; partial least squares discriminant analysis(PLS-DA)
目前原发性肝癌证候客观化的探索主要局限在生化、免疫、肿瘤标志物等指标与证候的关系上。这些指标与证候所具有的整体观念的中医“证”的内涵相去甚远，致使证本质的研究没有大的突破。这种状况将极大地阻碍了临床辨证论治和疗效判断的规范化，不利于达到循证医学要求的临床研究项目的实施。因此，寻求一种既能反应肝癌中医证候内涵又能为证候提供量化分析的研究方法十分迫切。
代谢组学是关于生物体内源性代谢物质的整体及其变化规律的科学[1]，其中心任务包括检测、量化和编录生物内源性代谢物质的整体及其变化规律，联系该变化规律与所发生的生物学事件或过程的本质[1]。从定义本身不难看出，代谢组学是将生物体作为一个动态的整体研究其内因或外因导致的代谢变化，这个定义的关键在于其整体性和动态性。这对于揭示复杂性疾病的机理具有独特的优势，与中医学的整体观、系统观和辨证论治思维非常吻合。阳虚证是肝癌重要基本证候之一，具有较突出的证候特征，因此，本研究选择阳虚证患者作为研究对象，以基于核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）波谱技术代谢组学方法来探讨原发性肝癌阳虚证患者血清代谢模式特征，期望为肝癌阳虚证的客观化提供依据。
1资料与方法
1.1一般资料
所以病例来自2007年10月-2009年5月期间长海医院中医科原发性肝癌患者，原发性肝癌的诊断标准符合2001年“原发性肝癌的临床诊断与分期标准”中临床诊断标准[2]，肝癌阳虚证患者的诊断标准符合原发性肝癌基本证候定性诊断标准，肝癌非阳虚证患者是应用原发性肝癌基本证候量化分析模型[3]阳虚证积分为0的患者。阳虚证组21例，男18例，女3例，年龄（55.76±12.79）岁，非阳虚证组21例，男19例，女2例，年龄（58.10±7.31）岁，两组在性别、年龄、肝功能Child-pugh分级、肝癌临床分期方面具有较好的一致性（P>0.05）。
1.2血清样品采集
纳入研究人员凌晨空腹8h后抽取静脉血5mL，静置2h后，室温下离心3500r/min×15min，吸取上清，分装于EP管存放在-80℃超低温冰箱备用。
1.3主要仪器与试剂
AVANCE II 600 MHz NMR波谱仪是瑞士Bruker公司产品；2,2,3,3-三甲基甲硅烷基丙酸钠{3-(trimethylsiyl) [2,2,3,3-2H4] propionate,TSP}为美国Aldrich公司产品；重水(deuterium oxide，D2O)为美国CIL公司产品。
1.4血清检测前预处理
血清样品室温下解冻，吸取上清400μL，加入TSP和D2O，使TSP终浓度为0.048%，振荡混匀，转移至5mm的NMR试管中待检测。
1.5NMR数据采集
在第二军医大学药学院分析检测中心NMR实验室进行检测。把装有经过预处理血清的NMR试管上机检测。在Bruker AVANCE II 600 MHz NMR波谱仪上记录血清一维质子磁共振氢谱（proton nuclear magnetic resonance，1H NMR）。采用Bruker公司的BBI(broad-band-inverse)探头，300K实验温度，预饱和方式抑制水峰，弛豫时间编辑(Carr-Purcell-Meiboom-Gill，CPMG)脉冲序列抑制血清中蛋白质及脂蛋白较宽的共振信号。采样时间2.04s，驰豫时间3.04s，谱宽7289Hz，采样点数64k，叠加次数128次。自由感应衰变(free induction decay, FID)信号经过32k傅立叶变换转为1H NMR谱图。以TSP为化学位移参考峰的位置，设为0ppm，校正化学位移后，对所获谱图进行相位和基线校正。
1.6数据处理和差异代谢物的鉴定
应用TopSpin 2.0把校正标准化后图谱转换成ASCⅡ TXT格式文件。根据分组要求把相对分组的数据放入同一文件夹。为了排除抑制水峰过程中变量的寄生效应(spurious effects)，删除1H NMR谱中4.60~5.00ppm水溶剂峰的区段。由于0.2~10ppm以外的区段可能有较多假象的干扰，而且内源性代谢物通常在0.2~10ppm以内的区段，所以分析数据的时候删除1H NMR谱中0.20~10.00 ppm的区段。实际分析的区段是0.2~4.6ppm和5.0~10ppm，按0.04ppm分段等距积分，以TSP内标（0ppm）为相对浓度的参照标准，采用Matlab7.0应用偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)对所有数据进行处理。对PLS-DA得分图提示能明显区分不同分组的差异代谢物(P 表1肝癌阳虚证组与非阳虚证组血清差异代谢物特征
序号代谢物名称δ1H（ppm）a质子归属变化趋势b
(阳虚/非阳虚)1VLDL/LDL0.84,0.92，1.24,
1.28,1.32CH3（CH2）n/CH3CH2CH2C=↓2异亮氨酸0.96δ-CH3↓3乳酸1.36,1.40CH3↓4脂类2.00,2.04CH2C=C↓5胆碱3.24N(CH3)3↓6葡萄糖/糖类3.28,3.40,3.44,3.48,
3.72,3.84,3.92Various,H1↓注：缩略词：LDL：低密度脂蛋白；VLDL：极低密度脂蛋白；a：代谢物化学位移，按内标TSP单峰为0.00ppm作参照；b：↓代表阳虚证组中该代谢物含量较非阳虚证组低。
3讨论
阳虚组和非阳虚组肝癌病例代谢谱PLS-DA得分图（图1）中得到很好的区分。其中主要差异代谢物鉴定结果得到6类代谢物，分别是VLDL/LDL、异亮氨酸、乳酸、脂类、胆碱、葡萄糖/糖类，而且这些代谢物在阳虚组较非阳虚组均明显下降。这些代谢物的变化构成了原发性肝癌阳虚证的代谢物特征，提示肝癌阳虚证的生物标志物不是单一物质的改变，而是多系统多途径代谢差异构成的“生物标志物群”。
进一步对差异代谢物生物学特征的分析可以看到，这些代谢物涉及脂类代谢、氨基酸代谢、糖代谢、能量代谢等多种代谢途径。分类讨论如下。
（1）脂类代谢：研究显示VLDL/LDL、脂类和胆碱阳虚证患者较非阳虚证明显降低，提示我们阳虚证患者脂类代谢的紊乱较非阳虚证者严重，这是区别肝癌阳虚证和非阳虚证的特征之一。VLDL运输甘油三酯可用于能量代谢（例如肌肉）或者储存（例如脂肪细胞），LDL运输胆固醇用于形成细胞膜和合成类固醇激素的各种组织。肝癌阳虚证LDL、VLDL、脂类（lipids）和胆碱水平的下降提示脂类代谢水平的下降，脂类化合物在组织间的转运减弱，机体对脂类化合物的利用可能下降，或者导致脂类化合物在某些组织异常积聚的可能。阳虚证患者一般胃纳较差，脾失健运，水谷精微不能很好地利用，导致体内脂类化合物总体水平的不足，而且阳气不足对水谷精微的输布能力下降，可能类似于VLDL/LDL脂蛋白对脂类的输送利用能力下降，结果表现为能量代谢低下、热能不足和脂肪储备不足，这可能是阳虚证感觉畏寒肢冷而且神疲乏力的原因之一。李英帅[7]应用1H NMR波谱代谢组学技术分析阳虚质人血中代谢谱特征也发现VLDL和脂类较平和质降低，阳虚质虽与阳虚证有区别，但发现脂代谢低下是一致的。在以后的研究中可以考虑应用NMR波谱技术设定为扩散编辑(longitudinal eddy-delay,LED)脉冲序列专门分析脂类变化的代谢组学来进一步分析脂类代谢物与肝癌阳虚证的关系。
（2）氨基酸代谢：本研究中，阳虚证差异代谢物中与氨基酸代谢相关的主要是异亮氨酸浓度的下降。异亮氨酸属于支链氨基酸，我们发现肝癌阳虚证患者异亮氨基酸水平较非阳虚证者下降，提示异亮氨基酸的下降是阳虚证的特征之一。以往阳虚证物质基础的研究中较少关注氨基酸与阳虚证的关系。有研究报道，老年人与中青年人给予相同营养条件条件下，老年人血中氨基酸水平降低，特别是支链氨基酸（包括异亮氨酸）显示不足，同时伴随免疫功能的下降，认为与激素水平的改变有关[8]。而沈自尹[9]认为老年人生理改变和肾阳虚证甚为相似，肾阳虚证也意味着一定程度上的未老先衰。由此可见属于支链氨基酸之一的异亮氨基酸与阳虚证之间的联系具有一定的病理生理基础。李英帅[7]的研究发现阳虚质人群的血液中谷氨酰胺含量增多，也支持氨基酸代谢与体质之间有密切联系，但与我们的阳虚证的结果不尽相同。肝癌患者支链氨基酸呈下降趋势，而阳虚证肝癌患者较非阳虚证者更低，提示其氨基酸代谢失衡更严重。
（3）糖代谢：在我们的研究结果中差异代谢物与糖代谢相关的主要是葡萄糖/糖类。肝癌阳虚证血中葡萄糖/糖类浓度较非阳虚证下降。糖提供人体所需能量的50％~70％，是机体主要能源来源和碳源。实验所用的血样是患者早晨空腹状态下采取的，早晨空腹血糖在肝癌阳虚证患者较非阳虚证下降，提示阳虚证患者可能更易并发低血糖。肝癌出现血糖降低有多种原因，如肝癌肿瘤细胞消耗大量葡萄糖，肝损害导致糖原酶系不足或功能失常，生成糖原的原料（氨基酸等）不足，胰岛素或类胰岛素物质过多而灭活不足。阳虚证肝癌较非阳虚证血糖低可能在以上机制中出现更严重的失调，有待进一步研究以明确。
（4）能量代谢：本研究肝癌阳虚证与非阳虚证的差异代谢物中与能量代谢直接相关的是乳酸水平的下降。乳酸是能量代谢的重要中间物。葡萄糖糖酵解生成丙酮酸，丙酮酸无氧条件下酵解成乳酸，同时伴有三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP)生成；乳酸又可重新转换成丙酮酸被氧化而产能，或被肝和骨骼肌糖异生为糖原。在平常状态下，人体大多数组织依靠有氧代谢途径供能，只有少数缺乏线粒体的组织，如表皮、神经、视网膜、肾上腺髓质、睾丸和血细胞等在有氧时也能进行强烈的糖无氧代谢。因此，常人在平静的状态下血中也可保持一定的乳酸浓度。乳酸水平的下降可能意味着这些组织中有部分组织或全部组织的能量代谢下降，可能伴随相关组织器官功能的下降。具体是哪些组织在阳虚状态时能量代谢改变，功能改变程度如何还需要进一步研究验证。李英帅[7]对阳虚质的代谢组学研究的结果与我们肝癌阳虚证的结果有较好的一致性，可能是因为试验方法和样本都一致有关，但要明确阳虚证和乳酸代谢等能量代谢之间的关系还需要更多的研究来证实。
另外，脂类、氨基酸、葡萄糖等都是重要的能量物质，可以通过多种代谢反应参与能量代谢。这些物质在阳虚证肝癌患者血清中明显降低提示阳虚证患者存在明显的能量物质消耗，能量产生不足。产热是能量代谢的效应的一部分，能量代谢不足可能是导致阳虚证患者畏寒肢冷的重要原因。能量代谢不足可以导致肌肉耐力下降，而表现为神疲乏力、喜静卧等阳虚证的表现。
综上所述，肝癌阳虚证与非阳虚证代谢谱的差异提示阳虚证特征性代谢网络的失调表现为脂类代谢、氨基酸代谢、糖代谢、能量代谢等多种代谢的紊乱或衰减，VLDL/LDL、异亮氨酸、乳酸、脂类、胆碱、葡萄糖/糖类等代谢物浓度的下降可能是肝癌阳虚证特征性的代谢物改变，是潜在的肝癌阳虚证生物标志物，值得进一步挖掘验证，为深入了解原发性肝癌阳虚证的生物学特征和实现肝癌阳虚证诊断的客观化、规范化提供依据。
参考文献
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